设计PCR用引物时的注意事项?

可以从以下几个方面考虑：

1. 引物长度通常为20～25 mer。但进行LA PCR时，引物长度应增长为30～35 mer。

2. 二条引物之间不能进行Annealing，对3′端的3个碱基需特别注意

3. GC含量在50～60%，避开局部富含GC或AT，为了使引物和模板稳定结合，3′端应避开AT rich结构

4. 避开引物自身形成二级结构

5. 选择Tm温度相互接近的二条引物

PCR用引物的Tm值的计算方法?

引物为20 mer以下时： Tm = 2℃×(A+T) + 4℃×(G+C) 

 引物为20 mer以上时：   Tm = 81.5 + 0.41×(GC%) - 600/L ， 其中L为引物的长度。

在PCR反应过程中选择Annealing温度时，一般为 (Tm - 5)℃。

PCR用引物的使用量?

合适的终浓度可在0.1 μM～1.0 μM之间选择。引物的浓度太低时，有时扩增产物太少；引物浓度太高时，比较容易出现非特异性扩增反应。通常模板DNA的量较多或High complexity DNA (例如Human genome DNA) 作模板时，引物浓度应低一些；当模板DNA的量较少或Low complexity DNA (例如Plasmid等) 作模板时，引物浓度应高一些。

简并性引物对PCR扩增有无影响?

有影响。简并数量应尽量少。通常一条引物中简并的碱基不要超过4处，如果简并的碱基数过多，则会造成反应体系中有效引物的量相对减少，此时应适当增加引物的使用量。但引物量过大，容易引起非特异扩增，应加以注意。