转化率高达85%以上的无病毒iPS技术

胚胎干细胞（ES）及其细胞疗法相关的进展不再详细说明。

目前存在的问题一方面是伦理方面的，另一方面培养ES细胞的过程是非常繁重的。一来需要额外的饲养层细胞；二来扩增传代中的集落挑选可能会导致更高的突变率。

    2006年，Shinya Yamanaka及其同事显示使用逆转录病毒将四种转录基因：Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc引入小鼠成纤维细胞内，可以生成具备多能性的多能干细胞（iPSC）。2007年，几个团体发现这种方式获得的iPSC能产生具有活力的嵌合体，但20%的嵌合体小鼠发生癌症。后期研究中，Yamanaka报道iPSC可无需c-Myc这一致癌基因的参与而生产，但过程需花费很多时间且不够有效。

    同样在2007年，由人体细胞生成的iPSC，成为iPSC技术的里程碑。腺病毒、质粒等开始应用于细胞重编程，尽管效率极低。

    2009年5月，通过Ding和Kim的实验室报道通过四种蛋白质的直接递送诱导产生了小鼠和人的iPSC（piPSC)。近期报道进一步显示可以试用mRNA来诱导。这解决了个体化干细胞治疗中最有挑战性的安全问题，允许科学家在制备iPSC的过程中不使用遗传学手段。蛋白质终将降解，所以在实验和治疗时不会造成任何长期的影响。这标志了iPSC细胞技术的重大突破。

    目前的iPSC细胞技术存在的四个重大问题：低效、耗时、复杂和昂贵以及质量问题。

    目前的iPSC技术仅将至多1%的体细胞转换为iPS细胞。对于使用非病毒方法，这个转换效率甚至＜0.1%。这是由于基因递送和蛋白递送的低效率，多重基因/蛋白质递送难以控制其化学计量。虽然已经开发了将多个基因插入一个病毒载体的方法来解决，但即使用于胚胎体细胞也只能达到5%的转换率。

    目前的技术包括基因递送和蛋白质递送，通常花费4-8周。这是由于低效的递送方式使得只有小部分基因可以到达细胞核。而仅有这部分细胞才可能被重编程。

    Ding和Kim的实验室都通过将细胞穿透肽（CPP，9R-11R）加入C末端内来改造重编程蛋白质。尽管CPP融合法确实将重编程蛋白质递送到细胞内，但是存在重大缺陷：

    1.CPP融合物具有改变重编程蛋白质的性质和功能的高危险。

    2.CPP具有低蛋白质递送效率。

    3.CPP递送的蛋白质对细胞内蛋白酶是敏感的，这会引起递送蛋白质的降解。

    4.CPP不具备对核的靶向性，而这个能力对于细胞重编程十分重要。

    Ding和Kim的实验室都采用了7-10个循环反复递送的方式来增加概率，但是由于以上原因，转换效率极低（＜0.005%）。在他们的论文中，整个重编程时间长达5-8周。

    更严重的问题是，经过50-60次传代后，iPS细胞展示出与起始体细胞相比较的重大染色体变化。使得这些iPS细胞无法用于人临床应用。

    基于QQ-蛋白质转运技术的技术的piPSC技术，允许重编程蛋白质在递送后1小时内高效靶向递送，直接进入细胞核。在12小时内开始体细胞的重编程。并在一周内完成细胞重编程。

    相关的实验数据证明，在采用常见的小鼠神经成纤维细胞的情况下，转化率能高达85%以上。可以实现全盘传代，从而也避免了挑克隆带来的个别突变被放大的问题。

    图1.QQ修饰的piPSC技术流程图。 

图3.在QQ修饰的重编程蛋白Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc加入人新生儿成纤维细胞（HNF）1.5h后，免疫荧光检测显示重编程蛋白被高效的准确递送入细胞并进入细胞核。

    图4.HNF与QQ修饰的重编程蛋白一起温浴12h，随后转入常规培养基培养108h。在24h、48h、72h和108h制备单层细胞进行免疫荧光检测。可以观察到：24h时，QQ修饰转运的Oct4可以在核和细胞质内观察到荧光信号；48h时，细胞质内的Oct4显著减少；72h时，细胞核内的Oct4减少；108h时，核染色再次显著增强。数据说明QQ系统将重编程蛋白靶向性递送入核，随着外源重编程蛋白的降解。108h时激活了内源Oct4的大量表达。这可以通过ALP、Nanog、Rex1和Tra-160的免疫染色加以证实。这个结果最终通过在6-8天时观察到的大量集落的形成加以证实。

    图5.AB重编程6天后可以在一个培养皿里观察到多达500-1500个piPSC集落。C-F通过调整实验条件，基本可以达到最终获得的细胞几乎是100%ALP阳性。

    图6.通过ALP、SSEA4两种表面标记和Oct4、Sox2、Nanog和Rex1四种和标记进行免疫染色、手工计数超过300个细胞，计算转化效率。

    采用30%piPSC（第四次传代）和70%HNF细胞混合物，进行免疫染色分析（六种标记，以下皆同），显示了阳性染色细胞的预期稀释度。全皿单层细胞传代和挑选单集落传代的细胞，在无饲养者条件下传代三代，使用免疫染色分析未观察到差异。同时对全皿单层细胞传代法扩增的piPSC第一代和第五代的Taqman Stem Cell Pluripotency Arrays。对Oct4、Sox2和Nanog基因表达也进行了qRT-PCR检测。SKY染色体分析也显示生成的piPSC和亲本HNF之间相同的核型。同时也做了Oct4、Sox2、Nanog和Rex1的Westen bloting检测来验证。

     使用全皿传代法扩增的piPSC具备多能性，可以分化为三个胚层的各种细胞。仅注射20万个piPSC到裸鼠的肾囊内就可以诱发畸胎瘤。

     该技术在科研和临床上具备广泛的应用前景，例如可以为病人生成该患者的个体化疾病模型；用于药物筛选和药物毒性测试；替代常规干细胞疗法等。

     由于保密的考虑，所有附图都只提供了清晰度有限的黑白稿。一些细节图也没有放上来。对该技术感兴趣的朋友可以联系我。panchao@qurgen.com