荧光染料RealTime PCR 通过加样调整副孔误差

Cт               Cт Mean    Cт SD    

21.86436    21.87578    0.021096    

21.86286    21.87578    0.021096    

21.90013    21.87578    0.021096    

先来一组数据，做熟练的同学可能不屑于这种表达量还算高的gene的误差控制，但是对于入门的同学而已，加样误差确实会干扰实验结果。

简单粗暴的调整方式总结如下：

1.按照引物分组，按照同一引物加样副孔+1准备试剂混合。比如下列糙图

                           geneA           housekeepgene（actinB）

sample1           o   o   o          o   o   o

sample2           o   o   o          o   o   o

按照引物geneA和内参actin分组，每组各6孔，加样7份，熟练的话6份

2.举例Takara20ul 体系的加样体系一般如下

SYBR 2                      10ul                X7（共7份） 70

primer F（10uM）   0.8u                                     5.6

primer R（10uM）  0.8u                                     5.6

DYE1 or 2                 0.4u                                     2.8

cDNA                         2ul                                      X

DEPC H2O                 6ul                                     42  

这么加样的目的很简单，比如2.8与2.79或2.78之间的误差肯定比0.4与0.39或0.38之间的误差小，那么通过将各孔累加的一起进行加样，间接减少了加样误差。

其次，即使有加样误差，因为同一引物，各孔的反应的浓度时一致的，在溶解曲线上，20u和19u不会出现熔解温度的平移，只是熔解峰高低的问题，扩张曲线的误差也不是很大，

3.按照上述体系200u管内总量是126u，按照54u一个管，一个sample分一份，这样，对应不同的模板能保证足够量的混合体系液。然后各个ep管按照标示加入6u cDNA，各管的体积就是60ul

如果按照每个八连管各孔20u移液会出现最后一孔液体不足的情况，这时候可以用单孔19ul移液，能保证液体足够。

通过放大加液量和缩小移液量可以把误差控制到很低，做的顺手的时候孔间误差可以控制到0.05而不是0.5.