【求助】细胞免疫荧光，每组都是荧光在核质内均可见

实验步骤如下:
1.细胞接种到6孔板,过夜,弃掉培养基,PBS洗1遍。

2.细胞处理

3. 4% 多聚甲醛固定25分钟，PBS洗2遍。

4. 0.5%Triton X-100通透20分钟，PBS洗2遍。

5. 3%BSA（PBST溶）室温封闭1小时.

6. 一抗用3%BSA1:200稀释,4度过夜，PBS洗2遍。

7. 二抗用3%BSA1:500稀释,室温1小时(避光),PBS洗2遍。

8.DAPI染核5min，PBS洗2遍,然后封片荧光显微镜下观察。    

我用的是小鼠神经胶质细胞，检测NF-kappaB的位置，照理说vehicle组的NF-kappaB在胞质内，而LPS诱导过的组NF-kappaB应该在核内，结果现在显微镜下每个孔都是核质内均有荧光，如图，前两张是vehicle后两张是LPS，实在想不通原因。