最近做免疫组化的心得体会

前言：

最近一个月一直在捣鼓着免疫组化，做到现在勉强能够做出来，但是也还是没有做出好看的图片吧。勉强凑合着用。能回家过年才是王道哈哈。

将最近做免疫组化的心得跟大家一起分享交流，如有不对之处欢迎指正：

能影响到免疫组化结果的因素有很多，我只说说我所碰到的一些因素，跟各位战友交流下了。

基本信息：

组织为C57小鼠移植瘤，4%甲醛固定有2周，由病理组同学帮忙制成石蜡切片。染色定位目标：血管

常见的血管标记 http://immunotech.dxy.cn/bbs/topic/12558994

有很多，我试过的有CD31，CD34，VEGF，VEGFR2（FLK1）。

下面进入主题：

1，石蜡切片的质量，做好免疫组化先有一张质量说的过去的片子，无皱褶，无气泡啥的。

CD31免疫组化求助    可以看看我的石蜡切片，原因就是展片的温度不够，没展平，有麻花卷。还好没影响最终染色的结果。当然也有阳性血管刚好被皱褶挡着了，只能挑其它地方拍照了。

2.抗体的质量。只能说选抗体须谨慎。有钱的当我没说了，肯定CST,Abcam的走起了。质量有保证。只有羡慕的份啦。。我就在国内市场上选择抗体，武汉博士德的早已被我拉黑了，压根没考虑，只试了下师兄留下来的一个抗体。别问我结果了。上海生工的之前跑蛋白的还可以，就买了个CD31的。结果是最后被资本家给坑了。说明书写着反应种属是人与小鼠。但做出来的结果是只能跟人的反应，与小鼠的没反应。与小鼠只有86%的同源性，公司也没有检测这个种属。只能说万恶的资本家。所以有人买生工的抗体做免疫组化的留个心了要。他家很多都写着反应种属是人与小鼠，但往往只检测的是人的种属，并未对小鼠的进行检测。一圈下来CD31的抗体，便宜的买不到了，小鼠的种属抗体挺少的。换了另一个公司的CD34 的。50ul，399元，老板要笑死了。反应种属大鼠，小鼠，人。公司不说了，可以猜去。

3.一抗的稀释度。一抗溶度低了可能检测不到抗原，一抗溶度高了可能出现背景深，假阳性什么的。现在的免疫组化试剂盒都是包含有工作液的二抗，不用摸二抗溶度，一抗溶度按照说明书推荐的指标浮动两个。最佳溶度基本也出来了就。

4.抗原修复。关于抗原修复，这个得看你的蛋白或者抗体说明书的要求来选择合适的抗原修复方法。但往往许多说明书都没有说该采取哪种抗原修复方法。所以就需要试一下了。

CD34我试过不修复的，0.1%的胰酶37度消化20分钟的。0.1M的柠檬酸钠微波修复，水浴修复的。效果都可以，没有看到有明显的表达差异神马的。最后直接采取不修复进行实验。

EDTA抗原修复也试过，热修复的。容易掉片。往往修复结束。组织就没了。干干净净。后来在EDTA里加了点

tris-Bas。一样修复完干干净净。尴尬啊。可能EDTA适合高压修复。也有可能我没有用防脱载玻片吧。

所以抗原修复往往因抗原而异。也因人而异。人才是主体。

5.免疫组化试剂盒的选择，现在主要集中在两步法和三步法上。

我选择的是两步法的，没有选用SABC那种三步法的。两步法就是直接多聚物标记二抗，起到放大信号的作用，代替了生物素的二抗。操作简单一个步骤。缺点就是比SABC三步法的贵。国产的试剂盒也挺好的。样本少的话可以选用的，没贵的那么夸张，不然嘿嘿嘿。哈哈。实验步骤按照试剂盒来做就好。一个操作工哈哈。

6.DAB显色后或复染后，往往要求脱水透明在封片。我是嫌麻烦在复染后片子吹干后直接中性树胶封片了。显微镜下也挺清晰的。不知道不进行脱水透明有没有影响。

7.现在染CD34有个问题，就是小血管能染得很好，而有的大血管却染不上。没看到CD34不能标记大血管的。不知道有没有战友遇到过这种情况的。

2张图供参考用，染色时间控制的不好，染色深了。背景调一调要好点

8，就这么多吧。