小鼠骨髓间充质干细胞原代培养经验总结——原创经验

做这篇总结的主要原因是导师的国自然课题与间充质干细胞直接相关，细胞问题是必须要解决的问题。导师十余年前曾留学日本，并在日本成功培养出了小鼠骨髓来源的间充质干细胞，但因时间久远，具体的操作流程已经遗忘。另外，当时的培养方法也不够成熟或已经被淘汰，导师回国后很长时间都没在参与过一线实验工作，对于现在的实验方法也不太了解。导师现在下了死命令，不行也得行，必须把这个细胞弄出来，而我作为导师第一个学硕研究生，这个担子不扛也得扛。

现在国内已经有很多做原代培养技术成熟的公司和课题组，但由于自身平台有限很难联系到那些课题组，且对方可能也不愿分享，而商业公司多以技术壁垒、商业机密、专利等借口不愿意提供具体培养的细节，在网上也难以获取靠谱的实验流程，国内外的论文也是各执一词，没有形成统一、高效的培养体系；大多数科研者也没有时间和金钱去验证其真伪，有的文章培养出来的干细胞连三系分化验证图都没有，而流式细胞术的验证图想要造假并不难，故本人认为这些文章的真实性都存疑。

本篇经验总结主要针对C57BL/6小鼠（简称B6）的骨髓间充质干细胞原代提取及培养，但从理论上讲也受用于其他种类小鼠。关于这个原代细胞，本人在ATCC上并未查见有细胞供应，加之间充质干细胞不具备长期多次传代并保持稳定的特性，故认为所有称其细胞来源于ATCC传代的细胞供应商均可认定为诈骗。之前看过一些论文称用间充质干细胞和另一个细胞融合或导入外源性端粒酶反转录酶基因获得了永生化的间充质干细胞细胞系，但这也只是一家之言，做科研最重要的品质就是对一切都抱有怀疑。若直接购买细胞无论是购买哪个公司的细胞均存在爆雷风险，所以还是想自己亲手做，毕竟实践才是检验真理的唯一标准。

在看了园子里大量帖子后发现年代久远，不成体系，所以最终收集了一些相对靠谱的论文和经验做了这篇总结。本经验的依据主要源自中国知网、pubmed小鼠骨髓间充质干细胞原代培养相关论文，国内做多物种原代细胞培养公司（SYSW和PNS）的一线技术人员和园子里其他帖子，论文引用实在是太麻烦就不贴了。因本人目前尚未培养出小鼠骨髓间充质干细胞，故对下述很多知识都是自身臆测，均不作真实性保证，只为分享知识和观点。非常希望能受到有小鼠骨髓间充质干细胞培养经验的前辈指导。

一、关于动物、试剂选择的问题

1. 小鼠选材的问题。

园子里有人说小鼠周龄越小越好（这点符合生理学理论，小鼠越小骨髓内干细胞的比例越高），确实很有道理。据PNS技术相关人员称他们使用的小鼠为10~20天的C57BL/6或昆明鼠。但存在一个问题是越小的老鼠骨髓的总量也越少，举例说明（1只10天的小鼠一根骨头冲出的总细胞量假设为100000，其中间充质占了10%，也就是10000个；而30天的老鼠骨髓冲出的总细胞量为500000，其中间充质占2%，也是10000，当然上述数据只是为了方便大家理解，具体的东西我没去查询论文验证，但我觉得真要往深了做，这个里面有东西值得研究）。

要我自己选择小鼠的周龄，我会先用周龄小的小鼠做，因为周龄小的小鼠干细胞的活性强、细胞干性高、细胞容易活，哪怕多用几只老鼠，只要能养出来就行（PNS的技术是用5只10天~20天老鼠的胫骨和股骨冲洗然后转移到1个25T的瓶里，多次换液长到80%后P1活细胞发货）。

2. 关于培养基选择的问题。

在培养基选择方面绝大多数文章使用的基础培养基有3种，分别是DMEM、DMEM/F12、α-MEM（在这三种培养基中首先的一个问题的糖含量，DMEM低糖的葡萄糖含量是在1000mg/L，高糖的含量是4500mg/L，而DMEM/F12的糖含量是3000多一点点，具体数值记不清了，α-MEM的糖含量是1000。之前在一篇国外的论文中看到过关于高糖的DMEM会促进干细胞的分化和老化的描述，如果这个结论成立的话那理论上DMEM低糖和α-MEM应该是优于DMEM高糖和DMEM/F12的）。

关于培养液中其他成分含量的问题主要集中在DMEM培养基中L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES的有无，α-MEM培养基中L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L谷氨酰胺、核苷有无。

对于L-谷氨酰胺的有无。

这个问题我请教过我们基础学院一位专门研究人源性干细胞的老师，它的建议是基础培养基一定要有L-谷氨酰胺，其他的物质不是非必须的，L-丙氨酰-L谷氨酰胺是作为L-谷氨酰胺的替代物，我并没有找到文章论述他与L-谷氨酰胺在小鼠间充质干细胞培养的对比研究，但是根据其性质本人推测从理论上讲L-丙氨酰-L谷氨酰胺的效果可能优于普通的L-谷氨酰胺。培养细胞的人都知道L-谷氨酰胺在溶液中的不稳定性，在受热情况下会被降解为谷氨酸和氨，而氨对干细胞和原代细胞的影响是尤其大的，而L-丙氨酰-L谷氨酰胺性质更稳定，溶解度也大，在常温下也不容易降解，这对于干细胞的生长来说可能更有利。

关于丙酮酸钠。

其作用是在葡糖糖含量较少或没有时作为细胞的碳源，即能量来源，由于DMEM和α-MEM内糖含量较低，我咨询了另一位研究小鼠卵母细胞的老师后，他给我的经验是以前养卵母细胞状态不好时通过加入丙酮酸钠可以有效的改善细胞的不良状态，故本人认为丙酮酸钠作为细胞的替代能量来源是有必要的。α-MEM培养基内丙酮酸钠是作为配方必需物存在的不需要作选择。

对于HEPE的有无问题。

HEPES作为一种强效缓冲剂，在维持PH稳定方面优于普通的碳酸氢钠和磷酸二氢钠缓冲体系，个人觉得是一个锦上添花的东西，况且α-MEM中也无法选择HEPES的有无，故自己认为HEPES的有无对于细胞的生长无明显影响。

关于核苷的有无。

核苷作为合成核酸的重要原粮，在胎牛血清中也含有一些核苷，细胞本身也可以合成核苷，但考虑到细胞快速增殖时细胞自身合成核苷的速度也许不够，故选择含核苷的培养基可能更好。

综上所述，如果选择DMEM培养基可选择含L-丙氨酰-L谷氨酰胺和丙酮酸钠的，HEPES的有无看个人喜好；如果选择α-MEM可选择含L-丙氨酰-L谷氨酰胺和核苷的。

在园子里有前辈的帖子提到α-MEM（L-谷氨酰胺）基础培养基，相比于DMEM（高糖、低糖）和DMEM/F-12效果更好，培养出的细胞增殖能力更强，细胞状态更好。另外PNS技术称他们自提小鼠原代骨髓间充质干细胞所使用的完全培养基是以α-MEM（含L-谷氨酰胺和核苷）为基础培养基加入10%的FBS配置的。结合这些经验，我自己会选择α-MEM（含L-丙氨酰-L谷氨酰胺和核苷）用于小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养。

3. 关于血清选择的问题

小鼠骨髓间充质干细胞对于血清等级的需求目前我不知道，但是我有养人脐带来源的间充质干细胞的经验，如果用有血清培养基培养，垃圾的血清肯定养不活，之前我用hyclone低糖的DMEM配biosharp的胎牛根本养不活，养一养就飘，然后就分化、老化，但是用来养癌细胞就嗷嗷长。根据专门研究人源性干细胞那位老师的经验如果用有血清培养基，血清的价格不要低于5000块/500ml，基础培养液不要低于500块/500ml。当然这些价格都是国外进口的官网价，实际在国内的一些代理商拿货可能也没这么贵。这是人的脐带间充质干细胞的要求，号称间充质干细胞里最难养的。小鼠骨髓间充质干细胞对于营养的要求可能会低点，但可以确信的是国产的那种新生牛或者很便宜的胎牛也够呛能养活，不知道国产替代的DMEM或是α-MEM能不能养出来。血清这个东西也有很多雷，指不定就买到假货啥的，所以尽量选择靠谱的购买。自己打算买gibco的澳洲优级胎牛10099141c先试试

4. 关于添加辅助培养试剂的选择

我自己对于商品化的成品细胞一直有个疑问，他们是如何在不同批次的血清和培养液的条件下均能培养出稳定的小鼠间充质干细胞。个人推测商品化的完全培养基内必定含有一些促进其增殖的生长因子以弥补血清中生长因子不足带来的影响，PNS的技术称其骨髓间充质干细胞完全培养基是专利产品，里面含有多种添加的生长因子，具体是什么含量是多少设计商业机密无法告知，但我在其官网上查到了它们运输骨髓间充质干细胞的培养基的成分，其中含有EGF和bFGF，所以我去查了文献发现这两个生长因子确有促进间充质干细胞增殖和生长的作用，但具体的浓度却不一。小剂量的EGF和bFGF肯定能促进间充质干细胞增殖，个人觉得可先尝试不加生长因子，如果细胞状态不好或是增殖缓慢可以尝试添加终浓度10ng/ml的EGF和bFGF，这个浓度不做保证，单纯臆测。除了生长因子，胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠等也对促进干细胞增殖有一定作用但没找到一篇成体系的文章描述具体的浓度和品牌。本人打算先不添加，视培养情况酌情而定。

5. 关于是否添加双抗的问题

如果对自己操作自信可不添加双抗，另外细胞要是真的污染，加不加双抗可能都没啥用，个人不选择添加。

二、关于实验操作的问题

1. 关于提取方法的选择

目前用于提取小鼠骨髓间充质干细胞的方法有很多，包括全骨髓贴壁、骨片消化、梯度离心、磁珠分选法，各种方法利弊我就不说了，这些都是比较容易获取的资料，但是我问了PNS和SYSW的技术都说使用全骨髓贴壁培养出来的，结合它们的成品细胞价格，我觉得用其他方法的可能性也不大。

鉴于导师经费和操作难度，选择全骨髓贴壁法

2. 关于动物解剖的问题

这一块涉及的雷很多，我看过一个视频直接将小鼠背部靠下皮肤剪开然后往下撕，把皮直接剥除后再操作，这种操作方式优点是视野清晰，毛发污染的可能性小，缺点是不是熟手可能直接在撕的时候把腹膜給撕破腹部内容物流出增加污染风险。第二种是在腹股沟皮肤处剪开然后撕下表皮，这种方法我觉得对于新手而言是比较理想的操作方式。

我个人会选择第一种，因为曾经有一年多的动物实验中心工作经历，并且有一年多的外科临床实习经历，动手能力也较强，应该能hold住。

暴露大腿之后涉及到取下股骨与胫骨的问题，视频看了几个，我觉得最好的方式是先剪断胫骨腓骨远端肌腱，然后剪断股骨上与髂骨连接的肌肉，拉扯整根大腿松动股骨大转子，最后将整根大腿取下，取下后减掉老鼠的脚，得到覆盖肌肉的股骨，髌骨与胫腓骨。用同样的方法将多只老鼠的覆盖肌肉的大腿全部取下，个人准备一次杀4只耗子取得8只大腿获取的细胞转入一个T25瓶里。

下一步是将肌肉与骨分离然后取股骨和胫骨，个人觉得用镊子夹住股骨远端和胫腓骨近端反生理屈膝方向弯曲180度可以很有效的将股骨和胫腓骨分开，之后就将股骨上的肌肉和胫骨的肌肉剔除干净后放在含有PBS或完全培养液的培养皿中保持湿润。

3. 用注射器冲洗的问题。

将所有胫骨和股骨取下后用眼科剪将干骺端减掉，暴露出骨髓腔，随后用1ml注射器进行冲洗，冲洗时应在冲刷干净和冲刷次数之间做好平衡，以此来减少细针头的剪切力对细胞的损伤；如果为了冲刷干净肯定冲洗次数就会增加这样就不可避免的累积剪切力对于细胞的损伤，另外将骨髓冲刷出来后不要进行红细胞裂解、离心等一系列操作，避免对细胞造成损伤，直接转入培养瓶或培养皿培养。

6. 冲洗后是否需要过筛的问题

冲洗之后最好不要筛网过滤，因冲洗出的骨髓中存在少许团块组织，其中含有部分间充质干细胞，若筛网过滤会造成细胞损失，且筛网过滤会延长操作时间，增加污染风险和对细胞的损伤。冲洗及转移至瓶内的这个过程在保证不出错的情况下尽量缩短时间，以减少对细胞的损伤。

7. 对于培养容器种类、质地的选择问题

对于无菌等级不高的实验室尽量选用细胞瓶代替培养皿培养可减少污染的概率，现在的培养瓶大多都是商品化的塑料培养瓶，因此在培养瓶质地选择这个问题上不用纠结，买一次性的塑料细胞培养瓶就行。

8. 关于换液时间的问题

由于不同的protocol中培养容器各异，个人会选择25T培养瓶进行培养，换液时间选择24h，48h，72h换液1次，之后根据细胞生长状况调整换液时间，只要细胞正常增殖后就可以正常换液与传代。

9. 对于传代的倍数问题

大部分的文章建议3代以前的细胞选择1：2传代，之后的细胞由于生长速度快，若传代密度大反而会导致细胞间相互接触而抑制生长并诱导其分化，所以3代以后尝试使用1:3传代。

10. 对于是否冻存的问题

有文章建议干细胞最好不要冻存，以防影响其生长状态，且冻存和复苏次数最好不要超过1次，以防止冻存和复苏过程对细胞生长状态及分化的影响。

最后希望自己能成功培养出小鼠骨髓间充质干细胞，毕竟等着细胞毕业，如果有成功培养出来的前辈希望您能在下面留言，期待各位前辈和通道的帮助。

如果有前辈和同道觉得需要补充的可以私信我，把这篇总结补充完整。

更新，在经过4次提取共杀死13只小鼠后成功提取出了小鼠骨髓间充质干细胞，下面说一下自己的经验，后续有机会会用GoPro拍个视频传上来

1.小鼠选材及失败经验

第一次共操作4只2周雄性B6小鼠，4只小鼠骨髓收集于25T细胞培养瓶，经过14天培养后失败，失败原因（考虑因细胞接种密度过大，第一次换液时间太晚导致杂细胞挤压了干细胞的生长空间）

第二次共操作3只2周雄性B6小鼠，其中2只小鼠骨髓收集于25T细胞瓶，另一只小鼠骨髓收集于25T细胞瓶，经过12天培养后失败（细胞密度低，第一次换液时间太长挤压干细胞生长空间）

第三次共操作2只4周雄性B6小鼠，每只小鼠骨髓收集于24孔板1孔内经过7天培养后失败（小鼠周龄大，细胞密度超大，换液时间太晚，杂细胞挤压干细胞生长空间）

第四次共操作4只雄性B6小鼠，其中2只10日龄，另2只2周龄，每2只小鼠骨髓收集于60mm塑料培养皿内，1天后即可见培养成功

对于小鼠选材，个人建议小鼠的周龄在保障操作前不死亡的情况下越小越好，但这里需要衡量操作难度的问题，小鼠越小操作难度越大。根据第四次成功的经验来看10日龄的小鼠骨髓间充质干细胞增殖速度明显强于2周龄的小鼠。但两者都能提取出来，至少说明2周以内的小鼠提干细胞是可行的。之前园子里有人提到干细胞传代代数低的问题，可能与小鼠周龄有关

第四次实验使用短时间多次换液以去除杂细胞的方法，减少杂细胞对营养物质的消耗，释放间充质干细胞的生长空间，通过降低培养液的高度可以使间充质干细胞快速贴壁。

本人使用的是1.5ml完全培养液在60mm培养皿内冲洗骨髓后让培养液均匀铺散于培养皿内，第一次换液在培养皿放入孵箱后3h（个人觉得这个时间可以缩短），之后每8h换液

此图是10日龄组第一个8h换液后的图可见一些间充质干细胞已经显现出典型形态

上面两图是10日龄组第二个8h（总计3+8+8=19h）同一个细胞集团在不同倍镜下的形态图，可见杂细胞已经大量减少

此图是2周龄组第二个8h（共19h）的低倍镜图，虽然仍有大量杂细胞（年龄大细胞数多）但间充质干细胞集团已经非常明显

上两图是全骨髓48h的镜下图，形态上不是很典型，但可见细胞密度大，细胞集团明显第四次的培养最后以污染告终，总结一下失败经验。

本次实验用了全骨髓贴壁和骨片法两种方法，个人觉得骨片明显优于全骨髓，主要体现在生长速度快，集落形成迅速

上两图是骨片法24h镜下图，明显可见MSCs从密质骨中迁出，且形态正常

上面两图是骨片法第5天的镜下图，可以见到密度极大，但此时细胞已经污染，在传代后第二天细胞几乎全部死亡，仅剩少量细胞残留，故选择放弃再次培养。失败原因还是实验环境和操作因素导致的细胞污染。

从实验环境上说，本人所在实验室为教学附属医院中心实验室，实验室对人员不做统一管理，没有任何形成条例的明文规定，细胞间内从不定期清理，地上杂物乱放，极易滋生细菌，细胞间通风系统十余年未曾清洗及更换滤芯，超净台为零几年产品，因长期不更换滤芯通风系统几乎报废，操作时多使用酒精灯预防污染；实验室内数个课题组，共十余人共用同一孵箱，操作水平及习惯各异，这些都是导致污染的可能因素。

从操作流程上讲有几点可以优化的地方

1.给小鼠剥皮时剪刀剪开背部皮肤的伤口应尽量小，这样可以尽量少的剪断毛发，防止因毛发带来的污染，如果直接从腹股沟处处理，个人觉得会增加操作复杂性及毛发污染风险

2.给小鼠剥皮的过程可将小鼠置于盛有适量75%酒精的100mm培养皿中进行处理，个人建议每次单人操作不要超过2只小鼠，2只小鼠的细胞量已经足够，再多会延长提取时间这对细胞活性是个重大打击。

3.为避免细胞污染可将小鼠整个大腿分离后置于含有双倍双抗浓度PBS的100mm培养皿中暂存，待2只小鼠共四只大腿全部分离后在同一培养皿中用眼科剪及眼科镊分离股骨和胫骨表面的肌肉，我自己分离时喜欢先用剪刀剪开髌韧带之后顺着这个剪开的缝隙将大腿分成股骨和胫骨两段，然后将胫骨远端的几根肌腱用眼科有齿镊从骨头上剥离，之后夹住肌肉将其从骨头上撕下来，因为自己对小鼠的解剖不太了解，我发现小鼠的腓骨似乎是和胫骨连着长，所以我会把那部分连着的腓骨也剪断然后剥下来只留一根胫骨，将这段骨头在另一个干净的含有1X双抗完全培养液的60mm培养皿中暂存

3.待所有骨头表面肌肉清理干净后用剪刀剪开两端骨骺，注意暴露骨髓腔后的骨头不要再放回原来的培养皿，可再备另一个含有双抗完全培养液的培养皿用于暂时存放已经剪开骨骺的骨头（骨髓腔内为无菌环境，剪开后放回原培养皿可能导致污染和细胞损失）

4.所有骨头干骺端剪完后用1ml注射器吸取培养液冲洗骨髓腔，将冲洗下来的骨髓液收集到另一个培养皿中（冲洗的时候避免骨头放进新的培养皿中，如果需要换方向可放回之前的那个培养皿调整），冲洗的时候尽量冲洗干净个人建议每个方向各3次，之前考虑的反复冲洗会影响细胞活性的假设并没有得到验证，所以尽可能的冲洗干净就行

5.冲洗干净后将含有骨髓的培养皿中的细胞悬液收集到15ml离心管中用1ml移液枪反复吹打至无明显细胞团后离心去上清（这步也可以去除潜在的细菌，因为细菌较轻，如果细胞间无菌等级高个人认为可以跳过离心这步直接讲细胞悬液吹匀后放入培养箱内3h后换液）

6.短时间内换液可以有效去除杂细胞，但为了防止干细胞的丢失个人建议在第一次换液时将换下的培养液接种到另一个新的培养皿中补加少量培养基放入孵箱内等待第一个8h后将2个培养皿同时换液

7.关于之前在网上看到说干细胞贴壁不牢的问题不用担心，个人建议除了第一个三小时换液时注意不要过度晃动培养皿外之后每8h换液时建议在换液前上下左右，左上左下右上右下各方向来回晃动培养皿5次以松动堆叠在贴壁细胞表面的细胞，为避免干细胞对培养环境的不适应前48h换液时不用pbs冲洗，48h后每次换液时可用pbs润洗1～2次，以润洗后pbs无色透明即可

8.关于换液时加液方式的问题，最好不要用移液枪从一侧贴壁往下加，这样可能会导致在加液那个方向上的贴壁细胞因冲击力太大被冲走，且杂细胞并不能得到有效的去除，建议用无菌巴氏滴管吸取培养液从培养皿上方1CM的高度在培养皿的不同位置滴入，这样能有效将堆叠在贴壁细胞表面的杂细胞冲起，但却不会冲走贴壁的细胞。

9.由于双抗在孵箱内易失效的问题，建议每一次换液时双抗现加，方法已经写在上面，为防污染，无菌PBS也可加入双抗

10.除开前3次换液时培养液因杂细胞含量大会出现浑浊，16h后（每8h换液2次后）有不明原因出现培养液有白色浑浊物，或骨片不再紧贴培养皿等现象基本可断定是污染，不要觉得培养液黄才是污染，不要浪费时间，直接做下一次。

后续不定期整理经验及进度

记第5次培养经验及进展

上两图是全骨髓法第一个8h换液前的图，杂细胞很多但已可见MSC表现出典型形态

上三图是全骨髓法同一位置48h换液后的图

上三图是骨片法第5天换液前的图，我在48h的时候将骨片转入了另一个培养瓶继续让msc从密质骨迁移，上图可见此时密度已经极大，我在第5天选择了1：2传代，传代的条件是25T培养瓶加入700ul胰酶室温1分半钟用力震荡一次之后加入3ml完全培养液1000转3分钟离心重悬，个人觉得非常好消化。

这张图是传代后旧瓶子里残存的其他贴壁杂细胞，可见还是有不少，个人建议不要为了保MSC的量延长消化时间，这不仅会对MSC造成损伤，也会增加杂细胞的比例。补几张图

上两图是P0以1:2传代后3h贴壁后镜下图

上两图为P1的48h镜下图

上两图为第二批次骨片P2的72h

关于干细胞冻存

本人P1代汇合度90%左右使用无血清冻存液冻存细胞，3个月后复苏，24存活率约60%，少量贴壁细胞形态发生改变，大多数仍具备两头细的梭型，复苏后生长速度有所下降，本人推测冻存复苏后对于干细胞的生长有较明显影响。

后期不定时更新，待实验结束后整理经验和各种雷

补充更新一下关于诱导分化的问题

1.诱导材料：最好是第三代未冻存的msc（此时细胞活力强，有较强的细胞干性，更能保证成功率和效率）

2.诱导试剂：前期有基础最好沿用以前的方法，园子里有位师姐总结了一张表，我感觉很靠谱，但由于我没有任何基础，且为了高效和成功率所以选用了已经商品化的成品试剂（苏州赛业，武汉普诺赛，这是国内的两个比较大的牌子，还有一些牌子大家可以问问自己试剂商）

3.诱导时间问题：成脂一般在10天左右，成骨2周，成软骨较长一般3～4周，但是我建议把成脂延长到2周效果会更明显

4.关于油红染色的小建议，在pbs水洗之后异丙醇水化20s，至于原因，用我仅有的化学知识我将其解释为油红不溶于水而溶于异丙醇等有机溶剂，这样做可以使着色剂更快的与细胞结合，达到较好的效果

5.额外的经验：我自己亲眼见过一个师弟的大鼠骨髓msc在正常培养过程中，同时出现了成脂（表现为细胞质内的透明高亮脂滴）和成骨（表现为细胞周围典型的方形晶状钙质结节）分化，如果各位有见到这种情况，可以拍下来，作为间充质干细胞多向分化的证据。祥见下图

补充一个骨片法的protocol，方法出自一篇nature protocol，链接在评论区一位老师的评论里

骨头先从中间剪成2半，再剪成小碎块，个人觉得越小越好，放5ml完全培养液，培养液里加终浓度1mg/ml的胶原酶2，骨片和培养液装15ml离心管里，封口胶封好后37度摇床上200rpm摇2h后离心去上清，把骨片种到一个25T瓶子里，48h后把骨片挪出来放到另一个新的瓶子里，这个挪骨片的操作可以做3次，可以得到3个批次的P0

另外关于有些同学说到的本帖被人侵权的问题，我自己无所谓的，大家看到顺手举报就好了，因为本帖本来就是学习交流之用，至于被copy出去也侧面说明了我这篇帖子的品质。侵权的人或许有商业上的需求或虚荣心的需求，whatever。另外侵权的人也不会有这些经验，别人问到他可能就不回复，或者一被问到就麻爪了。如果各位同行要转载或者拿去分享给师弟师妹啥的，注明出处就行，另外若各位有问题，我在我有限的经验内能回答的一定回答，希望我的经验能帮到各位，祝各位实验顺利。