几种基本蛋白质浓度测定方法比较（三）-评价

1.紫外法:

   紫外分光光度法是以紫外光为光源、波段在180～360nm的分光光度法。基本原理及仪器构造与分光光度法类同。主要用于有机化合物鉴定及结构分析，对具有π键电子及共轭双键化合物特别灵敏，还可对同分异构体进行鉴别。无机分析多用于定量测定。

   可以利用紫外分光光度法测定蛋白质含量。蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在275--280nm具有一个吸收紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，服从朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。该法测定蛋白质的浓度范围为0.1—1.0mg/mL。

   最常用的紫外吸收法是280 nm的光吸收法，含有核酸的蛋白质溶液使用280nm和260nm的吸收差较好。蛋白质的稀溶液采用215nm与225nm的吸收差法。

   紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定，测定后仍能回收使用。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。

   缺点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质较多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差，故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸在紫外区也有强吸收，但通过校正可以消除。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。

   此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。

2. 双缩脲法：

   双缩脲(NH3C0NHC0NH3)是两个分子脲经180℃左右加热，放出1个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以1个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。所有的蛋白质均有此显色反应。双缩脲试剂就是指能与具有两个以上肽键的化合物发生红紫色显色反应的试剂.它是NaOH和CuSO4两种溶液.在实验过程中,先在含蛋白质的溶液中加入等体积的NaOH溶液,混合均匀后,再滴几滴CuSO4溶液(量较少).即先后加入NaOH和CuSO4溶液.如果在NaOH中滴几滴CuSO4溶液混合后,再加入到含蛋白质的溶液中,混合液中就没有Cu2+,显色反应就不会发生.紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。

   双缩脲法中样品的取用量对测定结果的准确性有显著影响，采用0．5 g样品，40 mL双缩脲试剂的比例具有较高的检测精度。双缩脲法对不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，不受温度的影响。可快速测定蛋白质含量，试剂单一，方法简便，但灵敏度差，测定范围为l～2O mg蛋白质。适用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定，常用于谷物蛋白质含量测定。

    除-CONH-有此反应外，-CONH2-，-CH2-，NH2-，-CS-CS-NH2，等基团亦有双缩脲反应，会对实验结果产生干扰。

3. 福林酚法：

   显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin―酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin―酚试剂中的磷钼酸盐―磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。

   Folin―酚试剂法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。

   酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠―氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠―氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。

   使用该方法测定时要注意，由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用与测定蛋白质的相对浓度。

进行测定时，加Folin―酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜―蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸―磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即能发生。

   此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。

    此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。

4：考马斯亮蓝法：

   考马斯亮蓝法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝是一种有机染料，在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色，其最大吸收波长从465 nm变为595 nm，蛋白质在1～1 000 u g范围内，蛋白质一色素结合物在595 nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。

考马斯亮蓝法的突出优点是：

   （1）灵敏度高：蛋白质－染料复合物具有很高的消光系数，因此蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量为1ug蛋白质。据估计比Lowry法约高四倍。

   （2）测定快速、简便：染料与蛋白质的结合，大约只需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。

   （3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

此法的缺点是：

   （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 γ—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

   （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1M的NaOH，少量的去污剂可通过用适当的对照消除，而必要时必须预先处理样品。

   （3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度