【经验分享】WB快速上手，细节注意点及数据处理方法

详细的实验Protocal附文末，请根据实验室的试剂盒进行合理调整，文未有彩蛋!

基因表达的完全产物是产生相应的蛋白质或酶。因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志和重要方法之一，检测蛋白质的方法多种多样，除ELISA法外， 也可用与检测DNA和RNA相类似的吸印方法。前两法有"南”和”北”之意，故本法遂被延伸称为Western (西)印迹法， 该法能用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨出与专一抗血清结合的专一性蛋白质。将聚丙烯酰胺凝胶上分辨出的蛋白质转移到硝酸纤维素膜.上并与第一抗体共孵。再通过二抗结合一抗，显影液孵育，观察蛋白质表达量。

Western Blotting，即免疫印迹，是通过电泳分离目的蛋白质，进一步通过抗原抗体的结合来检测目的蛋白质表达情况的技术，它结合了SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率与抗原抗体反应的特异性，广泛地应用于检测特定基因表达产物的正确性，或者比较表达产物的相对变化量。

基本原理是:通过电泳将样品的蛋白组分开，然后将电泳后凝胶.上的蛋白质转移至载体膜上，用封闭试剂封闭载体膜.上未吸附蛋白质的区域，最后通过免疫学检测来分析特定的蛋白质表达水平。下面，我简单向大家介绍WB步骤的操作原理，有了基础的理解后，再上手就比较容易。

首先，从样本(组织或细胞等)中提取蛋白质，根据检测的目的蛋白的特性，判断是否加入特殊的试剂(如磷酸酶抑制剂)等，常规加入的是裂解液和蛋白酶抑制剂，主要目的是裂解样本，并抑制裂解出的蛋白酶解，蛋白需要低温保存，所以在提取蛋白质的过程中要注意冰上操作，离心机提前预冷等操作。细胞中皿可以分一半取蛋白质，一半取DNA，提蛋白质前，要把细胞离心管中的胰酶吸干净，避免降低消化效率，而组织只需要一小块， 但如果是皮肤，肺等质地坚韧的组织，需要匀浆彻底，超声波匀浆或者组织匀浆器都可以。通过这些步骤就获得了样品的总蛋白质。

接着，通过凝胶电泳进行分开样本中总蛋白。在电泳前，我们要先对上样蛋白质进行均- -化，也就是，上样量要一致，通过酶标仪(BCA法) 或者NanoDrop测定不同的蛋白质浓度， 计算上样量(一般按最低浓度的算，低浓度的样品，需要的体积就大)，- -般总上样量20-30ug即可，保证上样的样品间，体积一样，量一样。蛋白质带负电，在微观下有孔隙的凝胶中会向正极移动，但总样本中的蛋白质分子量不同，因此移动速度不同，我们先将样品总蛋白质压缩到同一起跑线，再变换电压，让其分离，为了能让这些蛋白质更好地在凝胶电泳分开，要先将蛋白质变形成为一级结构，并加入Loading Buffer, -是帮助观察 蛋白质样本条带移动到哪里，二是加样时，能够在电泳液中沉降下去，形成好看的样本条带。根据样本数和上样量要调整不同的梳子进行配胶，胶一般提前配好，可以浸在电泳液或者纯水中短期保存。

既然通过电泳分离，就要知道，目的条带的位置，因此，跑前应该确定目的蛋白的分子量，选择合适的Marker和内参，配置合适孔径的聚丙烯酰胺凝胶。内参可以看看之前师兄师姐跑这个分子时用的什么内参，也要注意合理选择，不要离目的太近或者太远，同时，内参应该与研究分子无关，如超增强子可能会调控18S等内参，这时候用18s跑RT-QPCR和WB的结果就不稳定。

当目的条带分开了之后,我们再次利用蛋白质带负电的特性将其转移到特定的膜上，通过膜这个载体，进行后续的表达量检测。膜相当于有孔隙的一个个格子，把蛋白质转移进去，因此膜需要加入甲醇中激活，并浸入纯水中去极化，需要注意的是，不同分子量大小的蛋白质， 转膜时间和条件不同，需要根据实验经验进行调整，转膜也分为干转和湿转。下图为典型的湿转中三明治的结构。转膜完成后，要记得标记正面(蛋白面)和负面，这在孵育和洗膜的过程中十分重要;

再检测蛋白质表达量前要先进行膜的封闭，把膜中没有转入蛋白质的部分，用封闭液填充，常用的是5% Milk (TBST)，牛奶中含有大量蛋白质，可以很好地封闭膜，封闭完成，洗去多余的牛奶，洗膜时，蛋白面朝上，封闭时间和洗膜时间都需要注意，然后进行一抗孵育，让一抗和蛋白质充分结合，蛋白面朝下孵育，充分浸入一抗中，一抗可以用牛奶，TBST或者一抗稀释液进行稀释，不同的稀释方法，有各自优势劣势。一抗孵育完进行洗膜，洗完膜，通过二抗与一抗的结合，来观察蛋白质表达量的变化，主要二抗孵育后洗膜的时间和摇床速度，如果出现背景脏或者白膜要综合自己的操作去分析问题。

最后就是数据处理了，我把数据处理分为三步，分别是

详细的处理步骤就不在文章里赘述了，已经整理成WORD，步骤详细，可以快速上手，包括处理软件lmageJ也打包在里面。

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本期原理图片为引用，出处见文献。