07212016-Nature-Article-灵长类动物大脑发育转录组图谱

Title: A comprehensive transcriptional map of primate brain development

题目：灵长类动物大脑发育详细转录图谱

Abstract  The transcriptional underpinnings of brain development remain poorly understood, particularly in humans and closely related non-human primates. We describe a high-resolution transcriptional atlas of rhesus monkey (Macaca mulatta) brain development that combines dense temporal sampling of prenatal and postnatal periods with fine anatomical division of cortical and subcortical regions associated with human neuropsychiatric disease. Gene expression changes more rapidly before birth, both in progenitor cells and maturing neurons. Cortical layers and areas acquire adult-like molecular profiles surprisingly late in postnatal development. Disparate cell populations exhibit distinct developmental timing of gene expression, but also unexpected synchrony of processes underlying neural circuit construction including cell projection and adhesion. Candidate risk genes for neurodevelopmental disorders including primary microcephaly, autism spectrum disorder, intellectual disability, and schizohprenia show disease-specific spatiotemporal enrichment within developing neocortex. Human developmental expression trajectories are more similar to monkey than rodent, although approximately 9% of genes show human-specific regulation with evidence for prolonged maturation or neoteny compared to monkey.

摘要  我们对生物体大脑发育过程中基因转录物变化的情况了解得很少，特别是对人体和与人类密切相关的灵长类动物。我们因此绘制了一副猕猴（Macaca lulatta）大脑发育过程中基因转录物变化情况的图谱，这幅图谱所采用的样本来自猕猴胚胎阶段和出生后的各个不同阶段，各样本都有与人体神经精神疾病相关的皮层和皮层下区域各自不同的详细解剖定义。我们发现在猕猴出生之前，大脑中基因表达的变化要更大一些，这些更大的变化体现在那些前体细胞以及处于成熟过程中的神经元细胞中。我们惊异地发现猕猴大脑皮质各层以及各个区域形成类似于成熟大脑分子特征是在个体出生后很晚才完成的。大脑中各个不同的细胞群显示出各自不同的、具有发育特征的基因表达节奏特性，但这些不同的细胞群还在那些神经回路构建过程中表现出出乎我们意料的同步性特征，这里所说的神经回路构成过程包括神经细胞突出结构的形成以及细胞黏附作用。那些对包括原发性小头症（microcephaly）、自闭症、智障及精神分裂症在内的神经发育性疾病形成具有风险性的基因会在正处于发育过程的新生大脑皮层中显示出具有疾病特异性的、在某些特定发育阶段的特定区域内表达较高的特点。人大脑发育性基因表达的轨迹特征与啮齿类动物之间的相似性不如与猴子的更相似，即使这样，人大脑发育过程中约有9% 的基因会显示出人类所特有的调节性，其证据是与猴子相比，人大脑发育成熟所需的时间要比猴子长得多，大脑在幼年时的基因表达特征会在人身体成熟后持续很长一段时间（neoteny）。

（正文）灵长类动物大脑的发育会经历一系列固定的过程，这些过程在不同种类的哺乳动物中呈保守性，它们包括各种不同类型细胞的特化（specification）、迁移和成熟，以及功能性神经回路的形成和改进。当然还有一些灵长类动物所特有id大脑发育的一些特征，这些特征会使灵长类动物大脑在解剖水平、认知水平和行为水平上的复杂性有所增加，这些特征还可能使我们弄明白为什么人类的许多神经性疾病和精神性疾病不适于在啮齿类动物中建立模型。这些特征包括在灵长类动物的大脑的室下区外侧存在着非常大的皮层前体细胞群，而这是啮齿类动物所没有的，另外在灵长类动物的大脑中还存在着特有的髓鞘生成延迟（protracted myelination）、突触形成和突触修整等现象。与小鼠相比，猕猴和人都有一个很大的大脑新皮层以及许多特化的大脑区域（最引人注目的就是初级视觉皮层），这些特征反映出猕猴和人类的共同祖先（两千五百万年前）要比人类和小鼠的共同祖先（七千万年前）年轻多了。同样，猕猴和人类的大脑要比人类和小鼠的大脑之间共同具备的基因表达模式多。因此猕猴可以为我们提供一个可以表现人类大脑发育的非常有价值的替代物，特别是针对那些在人体中很难实施采样的胚胎阶段和刚出生的发育阶段时期的人的大脑，猕猴还可以为我们在研究人类所特有的性质比如大脑成熟期超长或者称之为幼态持续（neoteny）时给出一个比较对象（comparator）。

由于所有动物体内负责大脑发育的分子机制在时间和空间上都具有非常高的复杂性，而能够探测这些复杂性的方法又很有限，因此我们对这些分子机制的了解还很不完整。基于转录组的研究方法有助于加快我们对那些与成熟以及正在发育的人体和猿猴大脑结构和功能有关的基因表达过程变化的理解，然而这些理解中还带有很有限的解剖分辨率和发育覆盖性。最近有人对成熟小鼠和人体的研究已经对单个大脑皮层细胞的特征进行了记录，他们证实了在生物个体的发育过程中神经类细胞和非神经类细胞之间存在着明显的转录方面的差异，同时在发育过程中这种差异变化的幅度非常大。虽然这些研究结果针对所研究的目标来说给出了细胞水平上的认识，但在发育过程里所有不同细胞整体上基因表达的变化情况我们还不清楚。

本研究的目的就是要绘制出一幅非人灵长类动物大脑的转录物图谱，这一图谱在动物大脑中那些与神经精神性疾病形成相关的区域中会呈现出动物个体出生前后发育过程各个不同时间范围内的详细解剖准确性。我们还将通过成像和基于组织学的分析参考文献以及具有细胞水平分辨率的原位杂交（ISH）数据来对所得到的这些转录物数据进行补充，所有数据都可以通过NIH的非人类灵长类动物基本图谱项目网站（NHP Atlas）获得（链接1和链接2 ）。

具有时间空间特征的转录组分析结果

这一结果通过三种方式表现了猕猴前脑发育的特征，这三种方式是：（1）由磁共振（MRI）成像及对应密集取样尼氏染色结果；（2）由高通量ISH平台产生的细胞水平的基因表达数据；以及i（3）由激光微切割（LMD）和DNA微点阵结合产生的具有精细解剖分辨率的系列时间点转录组数据（图1a）。我们集中对新皮层（包括内侧额叶前皮层和视觉皮层区域）、海马体、纹状体以及杏仁体中不同的神经前体细胞以及不再分裂的神经细胞群进行了分子生物学分析（图1b，补充表1，2）。我们选定了十个发育时间点（今后文中称之为样本的十个不同“年龄”）来对应那些神经元形成的峰值阶段和几个主要的个体发育时期即新生儿期、婴儿期、青春期和成熟初期（图1c，出生后阶段），这些集中阶段形成的神经元主要指的是大脑各层结构中的神经元细胞以及V1类型的胶质细胞（出生前阶段）。对各个时间点上样本的解剖性区域划分依据的是之前针对猴子和人体大脑发育的研究结果（扩展数据图1）。那些标志着不同神经细胞类型的经典基因显示出了我们所预期的、在整个发育过程中具有不同时间和空间特征的表达模式，我们将其表达模式以热图的形式来表示（图1d，扩展数据图2），这个热图中的解剖性组织结构的内容依据图1c。

为了对皮层发育过程中转录物的动态特征有更进一步的理解，我们采用基于相关性表达结果的多维标度（MDS）来表达各个大脑皮层样本之间的相似度（图1e-g）。在所有的样本（n=922；图1e）和出生前样本中（n=542；图1f），几乎90% 的不同层样本以及不同年龄样本之间显示出差异性。为了检测各个不同类型神经细胞间更小的差异（图1f，灰色圆圈），我们只对V1类型的皮质层（包括各种类型的兴奋性神经元；n=175；图1g）再做MDS分析。如同之前在成熟猕猴大脑中得到的结果那样，大脑各层转录组结果的相似性反应出了各层空间上以及发育时间上的相近。还有出生前发育中的样本显示出其转录组处于持续变化之中，说明基因表达发生了逐渐的变化。

Figure 1 | High-resolution transcriptional profiling of rhesus monkey brain development.

a, Neuroimaging, histological and transcriptome data components.

b, Brain regions analysed.

c, Primary visual cortex (V1) sampling paradigm for transcriptome analysis spanning ages from 40 embryonic days (E40) to 48 months (mo) after birth, with salient developmental events or stages noted (top row). Whole brain or hemisphere sections are shown for each age (V1, red box outline), as well as a high magnification Nissl image detailing laminar microdissections. Cortical layers profiled at each stage are colour-coded by predominant mitotic (red, pink) or postmitotic (orange, yellow, tan) cell makeup.

d, Heat maps of canonical cell type marker gene expression organized anatomically as in c.

e–g, Multi-dimensional scaling (MDS) plots showing the first two principal axes of variation for all cortical samples (n = 922) (e), prenatal samples (n = 542) (f) and postmitotic layers in V1 (n = 175) (g). Scale bars in c: 1 cm (top and middle rows) or 1 mm (bottom row). Structure abbreviations are given in Supplementary Table 1.

图1  猕猴大脑发育过程中高分辨率转录物特征

a，神经成像、组织学和转录组的数据组成。

b，所分析的大脑各区域。

c，从胚胎形成40天（E40）到出生48个月（mo）之间各个不同阶段用于转录组分析的初级视觉皮层（V1）取样示意图，其中具有显著性特征的被标注出（上排）。图中显示了各个阶段整个大脑或者半个大脑的切片（V1，红色方框区域），以及基底微切割组织切片的Nissl 染色结果成像。各发育阶段大脑皮层按主要有丝分裂（红色，粉色）型或者有丝分裂后型（桔色，黄色，棕色）细胞组成进行颜色标注区分。

d，按照c图中解剖性位置的经典细胞类型基因表达标记结果热图。

e-g，多维度分析（MDS）图显示所有皮层样本（n=922）（e）、出生前样本（n=542）（f）和V1中有丝分裂后类型层结构杨本（n=175）（g）中变异中存在的的前两个主要因素。c图中比例尺为1cm（上和中）或者1mm（下）。各结构缩写列表于补充表1中。

虽然本项研究并不具备针对大脑某一特殊区域或者某一特定发育阶段可以检测出其与其他区域或者阶段之间非常细微差异的那种能力，但我们确实没有发现在各样本间存在许多性别相关性的基因表达差异性的存在。只有一个常染色体基因（LOC693361，NADH-泛醌氧还原酶链1类似物）显示出个体出生前阶段雄性个体样本中表达持续增加的现象（扩展数据图3，补充表3）。然而针对LOC693361的微点阵探针还探测出猕猴Y染色体上一处未注释的区域，说明可能在整个发育过程中没有显示出具有雄性或者雌性特异性表达特征的常染色体基因存在。

之前的研究结果已经证实，在成熟的和正在发育的大脑皮层中不同的皮层结构里存在着不同的转录组特征，其中差异最大的是原初性细胞群与那些胚胎发育完成后不再进行有丝分裂的神经元细胞（post-mitotic cell）之间。对正在发育的人前额叶皮层来说，其基因表达在个体出生前变化迅速，而在个体出生后基因表达的变化突然变得缓慢。如果是那些正在分裂的细胞群造成了这种表达上的变化的话，那么将会进行分裂的前体细胞群去掉将会见到基因表达变化幅度降低的现象。但与这种假设相反的是，我们发现在大脑的整个发育过程中，V1和前额叶皮层中各个层结构具有非常相似的表达变化速率（图2a）。因此我们认为由于前体细胞群会形成各种不同的神经细胞和非神经细胞，因此在前体细胞群中转录性程序会发生很大的变化，同样由于那些不再进行有丝分裂的神经元细胞会在大脑成熟阶段发生分化和成熟，因此这些细胞转录性程序也会发生很大变化。

我们还在海马体、基底核（basal ganglia）和杏仁体中发现了类似的发育特征（扩展图4a）。但这些基因表达的变化会由于样本区域或者年龄的不同而有很大的差别。对于每个结构所有各个年龄之间成对样本的相关性表达方面，我们找出了具有最大和最小变化的前1000个基因，并将其表示在热图中（图2b）。之所以选择这样的基线水平是因为在主要解剖区域中所有年龄相邻样本之间至少有1000个基因的表达发生了显著性的改变（ANOVA 假阳性率FDR<0.05，表达倍数变化>1.25）（扩展数据图4b）。不同细胞群中基因表达随时间的变化具有惊人的同步性。在每一个发育阶段，大约有一半表达增加和减少最多的基因存在于大多数大脑的区域中，无监督聚类对样本进行分类所得到的结果几乎非常完美地对应各不同发育阶段（图2b中的样本年龄指数柱形图）。随年龄增加而表达增加的基因在出生前样本和出生后样本中各个阶段中有很大的重叠性，但在二者之间重叠性很小。这说明大脑在个体出生前和出生后的发育阶段处于不同的转录程序激活状态中，其中大多数程序是逐渐发生变化的。在发育早期由增殖状态分组的样本与大脑的解剖区域无关（图2b中的有丝分裂指数柱形图），说明存在共用的细胞分裂作用基因。个体出生后，杨本更趋向于按照解剖结构分类，说明在大脑成熟过程中各个区域特征逐渐形成（图2b中的结构指数柱形图）。

为了诠释这些动态基因表达模式，我们对大脑各个区域和发育阶段样本进行基因本体术语（GO term）富集作用搜寻（补充表4，5），并将结果按上述顺序以热图的形式表示（图2c）。比如，那些与轴突投射启动（正向调节）相关的基因如我们所预料的那样会在出生前样本中富集。令人惊讶的是，这一进程似乎在出生后的发育晚期受到了很大的抑制，因为那些与轴突投射终止（负向调节）相关的基因显示出从青少年时期（出生后12个月）到成熟初期（出生后48个月）这个阶段表达有所增加的现象。那些与突触发育有关的进程显示出暂时性地在接近出生时和出生后早期富集的现象，而且它们还在突触前（突触性囊泡位置）和突触后（树突结构发育）的神经元之间显示出同步性。有趣的是，在出生后视觉皮层（V1和V2）以及海马体中（图2b，箭头）的区域特异性协同表达的基因群中所含与自噬作用有关的基因较多（扩展数据图4c），这一现象可能反映的是早期树突棘修整作用以及视觉皮层中灰质体积减少的情况。

Figure 2 | Transcriptional dynamics across brain regions and ages.

a, Similar decreasing rates of gene expression change across cortical layers (rows, ordered from basal to apical) and areas (anterior cingulate gyrus, ACG, red; primary visual cortex, V1, blue).

b, Overlap of temporally dynamic genes across brain regions and ages. Proportion of the top 1,000 genes with increasing (red, upper triangle) or decreasing (blue, lower triangle) expression for each region between pairs of adjacent ages (for example, E50 compared to E40) that are shared with other ages and regions. Note large overlap between all regions at each age and within prenatal and postnatal periods. Arrows highlight region-specific blocks of coordinated expression. AM, amygdala; BG, basal ganglia; HP, hippocampus; FCx, frontal; OCx, occipital; PCx, parietal cortex; TCx, temporal cortex; THAL, thalamus.

c, Timing of neuronal connectivity-related events revealed by enrichment of GO terms in overlapping gene lists from b.

图2  大脑各区域及各发育阶段转录物动态变化特征

a，不同皮层结构（每行，按照从基底到顶端的顺序）和区域（扣带回，anterior cingulate gyrus, ACG，红色；初级视觉皮层，V1，蓝色）中基因表达改变下降的速率很相似。

b，大脑不同区域和不同发育阶段那些呈动态表达的基因的重叠性。在两个相邻发育阶段的成对儿样本间那些在其他区域中也存在的表达增加最多的1000个基因和表达降低最多的1000个基因所占的比例。注意在出生前样本中和出生后样本中的每两个相邻阶段样本间存在较大的重叠性，但这两组样本之间则不然。箭头指示协同性表达的区域特异性部分。Am，杏仁体；BG，基底核；HP，海马体；FCx，前额叶；OCx，枕叶（occipital）；PCx，顶叶皮层（parietal cortex）；TCx，颞叶皮层；THAL，下丘脑。

c，从b图中通过对那些相互重叠基因名单中对GO名词出现频率统计来说明与神经连接相关事件所发生的时间顺序。

生物进程的区域性时效

某些生物进程，比如突触的形成以及神经的髓鞘化作用，都会随发育的进行发生延迟，我们发现如果根据各个发育阶段中与进程相关性基因的表达有所增加而定义其为进程激活的话，那么进程激活所需时间要比进程失活所需时间长（图3a）。如果把所有区域性样本汇集在一起的话（黑线），生物性进程要比在单个区域内（彩色线）存在的时间长，因此发育作用的时效一定在各个区域间会发生变化。我们对成对儿的区域性样本之间对某些进程的同步性进行了定量，这些进程在某些发育阶段中的所有区域内都处于激活状态，采用的方法是比较在这两个区域中进程都处于活性状态的时间与在任意一个区域内处于活性状态时间的比例（比如扩展数据图5a）。令人惊讶的是，虽然在大脑各区域之间细胞组成和功能都存在着很大的差别，但针对GO中的术语所以成对儿区域样本都显示出同等程度的同步性。这种同步性集中在大约所有年龄的半值处（扩展数据图5b），远远大于所预计的随机性结果。很少的进程——包括细胞增殖、投射以及细胞黏附——会在所有的区域性和各个阶段的样本中都具有同步性。

生物进程通常会在出生前在所有的区域中启动，但有时会在不同的区域内不同的时间点上启动（图3b）。与已知的皮层下神经回路早期成熟作用这一结果相一致，各个不同区域样本中每一个进程启动时间的排列顺序表明皮层下神经回路形成得非常早，特别是在杏仁体重，新皮层和海马体具有类似的时效性（扩展数据图5c）。比如，皮层下苍白球（globus pallidus）的髓鞘化就比皮层白质的髓鞘化要早，而且它还会显示出较早的仅限于具有髓鞘化作用的寡突胶质细胞（oligodendrocyte）的基因（MOG、MOBP和ERMN）表达会有所增加的现象（图3c，扩展数据图5d）。让我们感兴趣的是，三种瓜突胶质细胞的标记物（MAL、ASPA和OPALIN）会在所有区域性样本中显示出同步性，说明神经髓鞘化作用的不同阶段在时间和区域上彼此互不相干。

Figure 3 | Variable onset of biological processes between brain regions.

a, Prolonged duration of biological GO processes. Number of ages at which increasing and decreasing GO processes are active in each region (colours) or in any region (black).

b, Synchronous and asynchronous onset of GO processes between regions, mainly beginning in prenatal development. Left: age of onset for all increasing GO processes ordered by onset in subcortical and then cortical regions (AM, BG, HP, then neocortex (NCX)). Right: GO processes predominantly begin earlier in subcortical than cortical regions.

c, Early onset (arrow) of mature oligodendrocyte marker MOBP in subcortical globus pallidus (arrow) compared to cortical myelin-enriched regions. Other myelin genes such as OPALIN show synchronous developmental timing. CA1or, hippocampal CA1 stratum oriens; V1 iz/wm, intermediate zone/white matter; ic, internal capsule.

图3  大脑各个区域之间生物进程启动的不同

a，生物GO进程的延迟期间。每个区域中GO进程增加或者减少的发育阶段数量标注为彩色，所有区域都存在的标注为黑色。

b，各区域之间GO进程的同步性和非同步性，主要起始于出生前发育阶段。左图为所有发生增加的GO进程的开始年龄，按照皮层下然后是皮层区域的顺序排列（AM，BG，HP，然后是新皮层NCX）。右图为主要在皮层下区域比皮层区域起始更早的GO进程。

c，与皮层中富含髓鞘的区域相比在皮层下苍白球中（箭头）成熟寡突胶质细胞标记物MOBP的早期表达情况。其它与髓鞘相关的基因比如OPALIN显示出其表达与发育的同步性。CA1or，起层（stratum oriens，大脑海马体的多形细胞层）；Vi iz/wm，中区/白质；ic，内囊。

成熟大脑皮层的特征在发育的晚期出现

新皮层是由各种不同类型的神经细胞所形成的层结构组成的，在成熟个体的大脑中这些不同的层结构具有不同的连接特性和转录特征，各个皮层区域之间这些特征可能会显示出逐渐变化或者完全不同的特性。一个神经元细胞会通过细胞自律性过程以及细胞在迁移、进程延迟和突触形成的过程中与环境间的相互作用来形成其自身的成熟分子特征。如果发育早期产生的神经元很接近它们的成熟状态的话，那么就说明细胞与环境的相互作用对这些神经元细胞终极分子特征形成的影响很小。因为我们发现在已经不会发生有丝分裂的皮层结构中还有大量基因表达变化的存在，因此细胞的内在因素和环境的外在因素对神经元的成熟可能都会起作用。

为了能够检测成熟神经基质特征的出现，我们对集中在大脑各层状结构中基因表达的模式从最早的、所有已经不能进行有丝分裂的层结构出现时的发育阶段（E80）到成熟个体形成阶段进行了比较。我们对各个层结构之间以及所有不同发育阶段成对儿样本之间的，针对每个发育阶段的V1中各层最具特征的前2.5% 的基因平均表达相关性进行了计算（参见方法和补充表6）。个体成熟的特征是逐渐出现的（图4a），其证据是随着发育基因表达的相似性降低，独特性增加。事实上，在成熟早期神经基质表达模式还与胚胎中期皮层的表达模式很相似（R<0.1）。

这些相关性趋势是从那些显示在不同层结构中具有特异性表达特征的基因表达几乎完全改变了的变化结果中得出的（指表达倍数变化>1.5；图4b）。大多数基因只会在发育的早期、中期或晚期的一段时间范围内呈现富集，很少有基因显示出一直富集的现象（图4b，c，补充表7）。在发育过程中各组基质性基因的表达会稳定地呈现出来，说明神经元亚型的功能特征是逐渐形成的，各层结构中不同亚型细胞比例上的变化也是逐渐完成的。针对GO术语来说，早期基质性表达的基因富集在那些早期发育事件中，比如神经元分化（P=1.6X10-7）和轴突形成（P=6.7X10-6），发育晚期的基质性基因则会富集在轴突导向（P=6.5X10-5）和神经支配（innervation）（P=9.8X10-6）上。

具有不同解剖特征和功能特性的新皮层区域在成熟个体中会体现出不同的基因表达模式，其不同主要会体现在V1中。在发育期间，内在因素（原谱说，protomap）和外在因素（原皮层说，protocortex）会对皮层区域特征进行修整。为了弄清楚那些说明皮层区域特化以内在性因素为主和以外在性因素为主基因区域性表达的时间动态特征，我们首先找出那些在各个不同发育阶段后皮层（caudal）（V1，蓝色）和前皮层（rostral）（ACG，红色）之间各个层结构中表现出差异性表达的基因（图4d，补充表8）。出生后晚期的样本要比出生前发育阶段的样本在已经不进行有丝分裂的细胞层结构的各个皮层区域之间显示出差异性表达的基因要多一些。这些基因主要集中在细胞黏附（P=3.9X10-6）和突触传递（P=7.3X10-4）相关性GO术语中，说明存在与皮层回路的功能性成熟作用相关的外在因素。发育性进程启动和实施的时间会在初级皮层的各个部分有所不同，其中神经生成在前侧皮层中发生得要比后侧皮层中早一些，但前侧皮层中神经回路的成熟会延迟到更晚一些的阶段，而且这一现象会在ACG（12到48个月）中与V1（3到12个月）相比那些富集基因更加推迟出现而再现。

为了检测那些内在性地对神经组织特化起作用的基因，我们对那些在下丘脑或者其他外界输入信号到达前某些区域性富集的基因进行了搜索。虽然有38% 的基因显示出区域差异性，但只有1% 的基因会在发育过程中呈现持续性（补充表8）。这些基因主要表达在不再发生有丝分裂的皮层层状结构中，比如CBLN2基因，而且只有20个基因（0.2%）表达在生发层（germinal zone），其中包括广为人知的呈后向前梯度分布的基因FGFR3和NR2F1（亦称COUP-TFI）。因此，虽然有证据说明有一小部分基因确实反映出发育早期内在性区域特化作用，但有更多的成熟阶段区域性差异可能是由于外在性相互作用以及神经活动依赖性机制造成的。

某些区域内差异可能是由于组成这一区域的各种细胞类型的比例不同以及这些细胞的成熟状态不同而造成的，比如处于分裂状态下的神经前体细胞、不再进行有丝分裂的神经元和胶质细胞。我们在V1或者ACG中找出了显著性富集细胞周期标记物（即正处于分裂状态下的前体细胞）的时空性位置，以及成熟小鼠V1中的GABA能和谷氨酰胺能性神经元，还有星形胶质细胞（图4e-h）。细胞周期标记性基因在E80到E90的样本中富集在V1 室下区（图4e），说明相对于ACG来说在V1中表面兴奋性神经元存在持续形成过程。与此相类似，那些兴奋性神经元的基因标记物（图4g）在出生前样本的ACG中富集，对应这些细胞在更早些的发育阶段形成和成熟。那些在出生后样本V1中标记性基因的富集可能会低于那些采用来自成熟小鼠V1标记物所得到的结果。在出生前样本ACG中星形胶质细胞的标记物富**呈现出从增殖层向非增殖层过渡的现象（图4h），说明星形胶质细胞在这些层结构中形成并发生了迁移。最后，对那些抑制性GABA能中间神经元的标记物显示在V1室下区（SZ）存在发育早期富集，这可能是早期中间神经元从内侧神经节隆起（medial ganglionic eminence）向后侧皮层迁移的标志。

在同一区域中表达的大多数基因会显示出在初级躯体感觉皮层（S1）中居中性表达，其位置大约在后侧ACG 和前侧V1之间的中段（扩展数据图6）。因此，从前侧倒后侧的梯度表达而不是ACG和V1的特殊性质，可能是驱动这些区域内表达差异性形成的主要因素。

Figure 4 | Protracted maturation of neocortex through young adulthood.

a, Expression patterns of genes best marking each cortical layer progressively change with time. Each dot represents the average across-layer expression correlation of the 10% of genes best distinguishing layers at one age (source list) with their expression levels in another age (comparison). Values are plotted against a scaled difference in age.

b, Layer-enriched gene expression shows progressive and extensive change with age. Binary heat map showing expression of layer-enriched genes (rows) across ages (columns). Genes are ordered and divided based on the median age of laminar expression into four chronological groups: early (median age < E120), middle (E120–3 months), late (>3 months) and persistent.

c, Developmental expression of representative genes from each chronological group in layer 6.

d, Number of genes differentially expressed between rostral (ACG) and caudal (V1) cortex in superficial (L2/3), deep (L5/6) and proliferative (SZ, VZ) layers across development. Most differences are found in postmitotic layers during early prenatal and late postnatal development.

e–h, Genes marking specific cell classes show regional enrichment consistent with earlier neurogenesis and gliogenesis in ACG compared to V1. Left column: enrichment of regional genes (d) with markers for cell cycle (progenitors) (e); GABAergic (f) and glutamatergic (g) neurons in V1; and astrocytes (h). Size of box indicates significance of cell type enrichment in a given layer, region, and age. Right column: expression levels (mean } s.e.) of canonical marker genes for each cell type in V1 (blue) and ACG (red).

图4  新皮层在整个成熟初期的延迟性成熟

a，那些针对每个皮层层结构的最佳标记性基因随发育时间的表达模式。图中的每个点代表在一个发育阶段时与另一个发育阶段相比最能体现出不同层结构的基因的前10% 在这一层中表达相关性的均值（比较值）。数值按不同发育阶段成比例差异性绘制。

b，集中表达在不同层结构中的基因表达显示出随着发育所发生的渐变和巨变。二元热图显示在整个发育过程中（列）集中在不同层结构中的基因（行）的表达情况。基因按照四个不同时期的基线表达水平达到中值时的发育时间进行划分和排序，这四个不同发育时期为：发育早期（发育时间中值<E120）、发育中期（E120-出生3个月）、发育晚期（出生3个月后）以及稳固期。

c，第6层结构中每个发育阶段的代表性基因的发育表达状况。

d，在整个发育过程中表面（L2/3）、深层（L5/6）和增殖层（SZ，VZ）结构中前侧皮层（ACG）和后侧皮层（V1）之间呈现差异性表达的基因的数量。大多数差异性表达体现在胚胎早期和出生后发育晚期的已停止有丝分裂的神经细胞层之间。

e-h，那些标记特异细胞类型的基因显示其表达集中在某些区域中，与V1相比，这些基因会持续表达在ACG中来促进早期神经细胞和胶质细胞的形成。左栏为集中在某些区域中表达的基因（d），这些基因中有细胞周期标记物（前体细胞，e）；V1中的GABA能神经元（f）以及谷氨酰胺能神经元（g）；以及胶质细胞（h）。方框的大小说明某一层、区域以及发育阶段中特殊类型细胞集中的显著性。右栏：V1（蓝色）和ACG（红色）中针对每一种细胞类型的经典标记性基因的表达水平（均值±s.e.）。

绘制那些与发育性疾病具有相关性的基因图谱

如果我们可以找到那些与许多神经发育性疾病形成相关的风险性基因都有联系的共同性途径的话，我们就可以对这些具有高度遗传性但遗传性特征非常复杂的神经发育性疾病进行跟踪。比如，最近针对自闭症（ASD）研究的结果表明这些疾病形成的风险性基因会共同表达在人的胚胎中期皮层神经元中，而且它们的表达汇集在突触发育途径中。大规模遗传相关性研究结果找出了一些具有高可信度的、与原发性常染色体隐性小头症（MCPH）、ASD、智障和精神分裂症等疾病形成具有相关性的风险性基因。我们在新的高分辨率图谱上在正在发育的皮层中标出了这些具有疾病形成风险性基因的位置。

我们采用加权处理过的基因共表达网络分析（WGCNA）方法来找出那些每个发育阶段皮层样本中具有相关模式化作用（模块）的基因群组，并将这些模块与各相邻发育阶段之间表达具有重叠性的基因联系起来，而且将这些模块在各种不同皮层层结构和细胞类型中的富集情况进行注释（图5a，补充表9）。接着，我们对前面得出的具有疾病形成风险性的基因群进行显著性富集检验（超几何分布检验，经验性校对P<0.1）。正如我们所预计的那样，MCPH基因显示出胚胎发育早期到中期在神经前体细胞富集模块中富集的现象（图5b），在这些模块中这组基因会使细胞周期动力特征发生改变，从而使神经元数量减少，大脑的大小变小。许多ASD基因显示出在个体出生前的已停止减数分裂的神经元中协同性表达的特征（图5c），这与之前的研究结果相一致，但在个体出生后也存在这一现象。相反，精神分裂症基因则特异性地只富集在从婴儿期到成熟期样本的已停止有丝分裂的神经元模块中（图5d）。

与智障形成具有相关性的基因并没有集中在任何基因模块中，这一结果与人们认为对许多生物性途径进行破坏都可能会造成认知能力发育出现问题的观点是一致的。为了研究这些不同的分子途径是否会汇集到智障的某些中间性表型中比如大脑的结构性组成障碍，我们在出生前和出生后的皮层样本中对71种智障形成相关性基因的表达相关性进行了研究。我们发现这些基因中存在四种主要的表达模式：（1）出生后皮质板（cortical plate）；（2）出生前生发层；（3）出生前室下区和皮质板；以及（4）发育过程中显现为更复杂的表达模式（图5e）。与之前模块分析的结果相一致，MCPH相关性基因之间具有非常相似的表达特征（多变量距离矩阵回归分析，P<0.001），它们集中表达在出生前生发区2号簇和3号簇中，要么是脑室区，要么是室下区。相反，其他表型并没有共同性的表达模式，这些表型包括皮层萎缩、抽搐以及代表其他大脑结构性障碍的小头症。还有，那些具有相似表达模式的基因可能会形成不同的表型。ASXL3和GRIP1会共同表达在3号簇中（R=0.80），但这两个基因分别于MCPH和胼胝体发育不良（corpus callosum agenesis）有关。

Figure 5 | Spatiotemporal localization of disease-specific associations in developing cortex.

a, WGCNA gene co-expression networks (modules; Supplementary Table 9) based on pooled V1 and ACG samples (n = 603) analysed independently at each age (columns). Modules were tested for significant gene set enrichment and overlap with hypergeometric tests. Modules significantly enriched for markers of glial cell classes (P < 10−15) or cortical layers (P < 10−30) are colour-coded and annotated. Remaining modules are coloured or labelled based on maximal expression in postmitotic (neuron-enriched; cyan) layers or progenitor or largely nonneuronal (WM, layer 1; orange) layers. Modules from adjacent ages with the most highly significant gene overlap (P < 10−50) are connected by grey lines.

b–d, Left: modules significantly enriched for risk genes associated with neurodevelopmental disorders (empirically corrected P < 0.1; red discs). Right: average expression pattern of genes found in at least two enriched modules.

b, Genes related to primary autosomal recessive microcephaly are enriched in early non-neuronal modules, and show maximal expression in prenatal ventricular zone.

c, Genes related to autism spectrum disorder are enriched in modules associated with cortical neurons, and show highest expression in cortical plate across development.

d, Genes related to schizophrenia show similar neuronal layer enrichment to autism genes, but restricted to postnatal ages.

e, Left: genes related to intellectual disability (ID) are associated with different brain malformations and/or seizures and show four major expression patterns over cortical development. Right: expression heat maps of known and candidate disease genes representing developmental profiles of each cluster. Intellectual disability genes also associated with primary microcephaly are significantly enriched in cortical progenitor-enriched pattern 2 (*P < 0.001; multivariate distance matrix regression permutation test). CC, corpus callosum.

图5  具有疾病特异性相关的基因在发育过程中皮层中的时空性位置。

a，基于将V1和ACG样本汇集后（n=603）针对每个发育阶段（栏）进行独立研究所得出的WGCNA基因的共同表达网络（模块；补充表9）。这些模块针对呈现出集中性显著的基因群进行了检验，其结果与超几何分布检验结果相重叠。图中对那些显著汇集了胶质细胞类型标记物的模块（P<10-15）或者皮层层结构（P<10-30）用彩色标明并加以注释。其余的模块按照已停止有丝分裂的层结构（以神经元为主，天蓝色）或者前体细胞层，抑或非神经元（WM，1号层；桔黄色）层结构中最大表达水平进行颜色标注或者注释。那些发育阶段相邻的而且具有最大显著性基因表达重叠性的模块（P<10-50）之间采用灰色线连接。

b-d，左：显著性集中了与神经发育性疾病形成风险性相关基因的模块（经验性校正P<0.1；红色圆）。右：至少在两个集中性模块中出现的基因平均表达模式。

b，与原发性隐性常染色体小头症形成相关的基因会集中出现在发育早期的非神经性模块中，并且会在出生前脑室区中呈现出最大的表达。

c，与自闭症形成相关的基因会集中出现在那些与皮层神经元相关的模块中，而且会显示出在发育过程中在大脑皮质板中表达最高的现象。

d，那些与精神分裂症形成相关的基因会显示出类似于自闭症相关性基因的集中在神经元层结构中显现的现象，但这些显现只会出现在出生后的发育阶段。

e，左：那些与智障（ID）相关的基因会与大脑结构障碍的形成或者抽搐的形成相关，这些基因会显示出在整个皮层发育过程中呈现四种不同表达模式的状况。右图：代表每簇发育特征的已知和待定疾病风险性基因的表达热图。那些还与原发性小头症形成相关的智障形成相关性基因会显著性地集中出现在含有大量神经前体细胞的皮层中，即2类模式（*P<0.001；多变量距离矩阵回归置换检验）。CC，胼胝体。

人体特有的大脑发育轨迹特征

与其他哺乳动物相比，人体会显示出特有的皮层和认知方面发育上的特征，而这些特征可能与基因表达方面的差异性相关。为了找出那些具有保守性以及离散性表达的基因来，我们对大鼠、猕猴的前皮层出生前和出生猴发育过程中的基因表达特征以及两套独立的人体数据进行了比较，并根据发育事件分值将时间范围进行均一化处理。不同物种中所显现出具有保守性表达特征的基因各有不同（Kruskal-Wallis 秩合检验，P<10-21），不同人体间相比灵长类动物间具有更高的相似性（Wilcoxon 符号排序检验，P<10-6），如同基于进化距离我们所做出的预计那样（图6a）。令人惊讶的是，大鼠无论是与人比较还是与猕猴比较都没有显示出具有显著性的保守性表达基因的差异性来，这说明人和猕猴自从共同祖先那里分开后的转录模式化作用是以相同的覆盖率进行进化的。平均来看，在三个物种中有69% 的基因具有保守性表达特征（R>0.5），而那些在整个发育过程中表达变化最大的基因甚至呈现出更高的保守性（扩展数据图7a，b）。比如，EMX2是一种对皮层区域形成（cortical arealization）具有重要作用的转录因子，CNTN1则是一种会引导神经元迁移和连接的细胞黏附作用基因，这两个基因具有高度的保守性（图6b）。

有一小部分基因（13%）显示出在灵长类动物和大鼠之间的差异性（在发育小鼠中的一部分基因得到验证，补充表10），大约有9% 的基因具有人体特异性特征。那些显示出不同保守模式的基因比例对于基因选择作用和表达相关性基线水平一直保持不变（扩展数据图7b）。某些差异具有动态特征，比如，BMP3的表达会在灵长类动物的发育过程中呈下降现象，但会在啮齿类动物中呈增加现象（图6b）。蛋白BMP3是一种WNT信号传导作用生长因子，有人在对狗的研究中将其与颅面变异之间联系在一起。CNTN2是保守性细胞黏附作用基因CNTN1的密切相关性家族成员，同样它也在灵长类动物和啮齿类动物中显示出相反的发育轨迹特征。在两组人的发育数据中，与其他物种所呈现的方向相反，LGALS1和LIN7A分别显示出表达增加和表达减少的状况。与小鼠相比，人的LGALS1具有一个不同的皮层表达成熟基质模式，而LIN7A的删除则与人的智障形成有关，在小鼠体内删除这一基因则会破坏神经元细胞的迁移和轴突的路径搜寻作用。

皮层发育中的某些方面，比如髓鞘化和突触修整作用，会在不同的皮层区域之间比较时某些区域中发生延迟，不同物种发育过程比较也会发现这些作用在某些物种中存在延迟的现象。我们认为基因表达方面发生突然的变化可能是发育重要标志性事件发生的体现，因此我们通过找出基因表达轨迹中特殊的变化或者基因表达的断裂点来比较不同物种发育的作用时间情况。在所研究的三个物种里，共有179种表达增加的基因和179种表达减少的基因满足这一标准，这些基因的表达情况与分段线性回归分析的结果拟合得非常好（补充表11）。与这些不同物种具有不同发育速率的事实相一致，那些表达增加（图6c）和降低（扩展数据图7c）的基因表达断裂点通常在大鼠中会较早出现，在猕猴发育的中期出现，而在人体发育中则出现的较晚。在表达增加的基因中几乎有一半（81个）与突触相关（图6c，虚线），而在这些不同的物种中那些基因表达的断裂点则会出现在估算其突触密度峰值出现的发育阶段（阴影方框，图6c，扩展数据图7d）。人体V1与前皮层之间突触相关性基因表达的断裂点之间并无显著性差异，而在猕猴的V1中只有一点点延迟（42天，P=9.6X10-9，扩展数据图7e），这与之前报道的在灵长类动物中发现同步性突触形成的现象相一致。之后有人发现在人体内存在突触形成延迟的现象，但得出这一结果所依据的样本有限，而且没有统计分析，所得到的结果与大量证据之间似乎存在不一致性。

虽然在不同物种之间基因表达断裂点出现的时间（即基因表达发育轨迹中斜率发生变化的时刻）基本上呈保守性，特别是在猕猴和大鼠之间（扩展数据图7f），但人体基因表达断裂点的分布呈清晰的双峰态（图6c），说明人体中某些基因具有不同的发育时间性。比如，OLIG1会在成熟过程中的寡突胶质细胞中表达，它的表达相对于猕猴来说呈现出断裂带出现较晚的现象（图6d），这与人体与猕猴和黑猩猩相比在几处皮层区域的髓鞘化上呈现延迟的现象是一致的。令人惊讶的是，在人的前皮层中有更多的基因呈现出断裂点较早而不是晚出现的现象（图6e），这与之前研究的结果是相反的，之前的结果显示在人体这一大脑区域中存在人所特有的基因表达峰值延迟出现的现象。我们发现有许多早就开始表达的基因会在个体成熟期持续增加表达（图6e），比如SYT7（图6d），它是一种突触前钙结合性蛋白，对于神经递质释放的修饰具有重要作用。在猕猴中，基因的表达通常在断裂点之后不发生显著性变化。那些带有早出现断裂点而在发育晚期又呈现峰值表达的基因可能标志着某些特殊的发育进程，这些进程在人体中相对于非人灵长类会发生延迟，这些进程可能是我们人类认知能力形成的基础。让我们感兴趣的是，我们发现这种在物种之间呈现出的幼态持续（neoteny）的转录物特征在前额叶皮层和V1中都存在，但在那些进化过程中更久远的结构中出现的很少，比如海马体、杏仁体和纹状体（图6e，扩展数据图7g）。

Figure 6 | Conserved and human-specific gene expression trajectories in frontal cortex.

a, Left: box plots of pairwise correlations between developmental expression trajectories (median } 25th and 75th percentiles, whiskers at 1.5 times the interquartile range) of orthologous genes profiled in rhesus monkey, rat and two human data sets. Kruskal–Wallis rank sum test, post hoc Wilcoxon signed rank paired tests: *P < 0.001 (Bonferroni-corrected), NS, not significant. Right: Venn diagram showing the number of conserved (R > 0.5) genes between each pair of species.

b, Examples of conserved and species-specific gene trajectories. Colours and symbols are consistent in b–d.

c, Distribution of breakpoint ages for 179 orthologues (solid lines) of which 81 were synapse related (dashed lines) in frontal cortex and V1. Shaded bars indicate periods of peak synaptic density (95% confidence intervals) in each species (Extended Data Fig. 7b).

d, Genes with unexpectedly early (SYT7) and late (OLIG1) breakpoints in expression trajectories in human. Observed breakpoints (dashed lines) compared to expected breakpoints (dotted lines) based on timing in rhesus monkey.

e, Many genes in human cortex have early breakpoints followed by prolonged increase in expression. Left: comparison of breakpoint timing (points with 95% confidence intervals) between human and rhesus shows a biased population of early breakpoint genes in human cortex but not striatum. Many of these early breakpoint genes continue to increase expression through young adulthood (red) in contrast to genes with relatively conserved timing that tend to plateau (grey) or decrease (blue). Ages corresponding to equivalent (solid lines) or nearby (dashed lines) developmental stages (event scores within } 0.2; see Methods) in human and rhesus monkey are shown. Right: bar plot summarizing the number of genes that have an early or late breakpoint in human in different brain regions.

图6  前额叶皮层中那些保守性的以及人体所特有的基因表达轨迹

a，左：猕猴、大鼠和两套人体数据中直系同源性基因在发育性表达轨迹之间成对儿相关性箱式图（中值± 25th和75th 百分率，箱须为四分位值的1.5倍）。统计所采用的报刊Kruskal-Wallis 排序秩合检验，事后Wilcoxon 符号排序检验：*P<0.001（Bonferroni校正），NS，无显著性。右：Venn氏图显示每两个物种间呈保守性的基因数（R>0.5）。

b，保守性和种属特异性基因表达轨迹的例子。从b到d图采用统一的颜色和符号。

c，在179个直系同源性基因（实线）中81个在前额叶皮层和V1中与突触有关的基因（虚线）表达断裂点出现时间的分布情况。阴影直方图说明每一物种中峰值性突触密度出现阶段（95% 置信区间）（扩展数据图7b）。

d，在人体中显现出乎意料早（SYT7）和晚（OLIG1）基因表达轨迹断裂点的基因。图中显示出与基于猕猴发育时间作用性的预计断裂点（点虚线）的实际基因表达断裂点（直虚线）。

e，在人体皮层中许多显示出表达轨迹上很早出现断裂点的基因会随后显示表达持续增加的现象。左图：人和猕猴基因表达断裂点出现的时间比较（各点显示置信区间为95%）结果显示在人的皮层中存在一组具有早期断裂点的基因，但在纹状体中则没有。这些具有早期断裂点的基因中的大多数会在人的青年期还持续显示表达增加的现象（红色），这些基因与那些具有相对表达保守性的、在发育后期表达会趋于平台（灰色）或者降低（蓝色）的基因的现象相反。图中显示出发育阶段相同（实线）或者相似（虚线）的人和猕猴的情况（事件分值在±0.2之内，参见方法介绍）。右图：直方图显示在人体内不同大脑区域中具有表达早期或者晚期断裂点的基因的数量。

讨论

本研究通过对转录组的研究，详细记录了从胚胎早期到成熟初期的、带有详细解剖特征的灵长类动物大脑发育的过程特点。虽然在整个大脑发育的过程中某些基因表达的变化会达到100倍以上，但我们发现灵长类动物在从成熟初期到成熟期这个过程中基因的表达变化不大但彼此密切相关，这个时期正是人体大脑中大量认知性能力形成的时期，也是神经精神性疾病容易形成的阶段。这些基因表达上的变化与后来成熟基质性和大脑皮层区域性特征的形成相关，也与像轴突路径寻找作用的负性调节这样的生物途径有关，而基因模块的出现则明显与ASD和精神分裂症的形成相关。

大脑发育过程中某些基因表达轨迹所表现出来的两个出乎意料的特征支持外在性因素决定大脑发育过程中转录调节作用的观点。第一个特征是在不同的大脑区域和细胞群中基因表达的变化存在惊人的同步性，这说明其中存在着某种广泛性机制，比如循环性激素的产生。其次，那些接近成熟的皮层区域和基质性分子表型非常晚形成的现象说明在对成熟细胞性表型修整中环境和神经活动依赖性机制起着重要的作用。

我们发现，在大鼠和人体内有22% 的基因显示出差异性发育表达轨迹，这与之前其他研究报道的成熟小鼠和人体大脑皮层中有25%  的基因具有差异性基质性表达模式的结果差不多。相反，在猕猴和人体之间大约有9% 的基因显示出差异性表达轨迹，其中包括那些只会在人体皮层中呈现延迟峰值表达的基因。因此，猕猴是理解人体特异性大脑发育特征的一个重要的对比物，但猕猴不能完全模拟出那些只能在人体中见到的延迟性神经回路形成以及相关性疾病形成的过程。

最近一项研究得出的ASD相关性待定基因名单中的基因显著性地集中出现在胚胎发育过程中新形成的神经元细胞内，这与之前研究得出的结果相一致，但这些基因在我们的研究结果中显示还会集中出现在个体出生后的发育过程中。那些神经分裂症形成风险性基因也会集中出现在神经元细胞中，但只有在个体出生后的婴儿期才会发生，这说明神经分裂症的形成过程中神经回路的加工修整要比胚胎发育时期比如神经的形成所起的作用大。在婴儿期神经分裂症风险性基因和ASD风险性基因都会集中出现在同一神经元集中的模块中，虽然二者之间只有5% 的基因重叠，这说明两种疾病可能具有相同的起因，目前持这种观点的人们越来越多。

我们得出的这一数据集合（http://www.blueprintnhpatlas.org 和 http://www.brain-map.org）具有许多应用方面的意义。比如，它可以用于针对体外环境中干细胞衍生性神经元细胞的特征和成熟来建立一个体内条件基线水平。最近人们在技术方面所取得的成就使我们可能对单个细胞的全转录组、全表观组以及最终的全蛋白组进行研究。这些技术使我们可以将这里所得出的大略性结果精细提炼，从而使我们得出对那些具有因果性的分子程序的理解，正是这些程序驱动了功能性神经回路中灵长类动物大脑细胞各种谱系的形成和特殊神经元细胞的成熟。（全文完）