【求助】结肠固有层单个核细胞的分离

    最近在做结肠固有层单个核细胞分离和后续的磁珠分选，尝试了很多次。磁珠分选已经比较熟练了，主要是前期肠组织的处理这块感觉遇到了很大问题，Percoll离心后看不到中间的细胞层，将中间若有若无的细胞吸出来台盼蓝染色计数后细胞存活率只有20%左右。
我用的是2007年Nature Protocol这篇文献上的方法，主要过程如下：1.取2-3只左右小鼠结肠组织，冰生理盐水冲洗肠内容物，将肠道剖开，剪成4-5cm的片段；2.放入10ml含1mmol/L-DTT、1mmol/L-EDTA和10%胎牛血清的不含镁离子及钙离子的HBSS孵育液，37度摇床40rpm/min孵育20分钟（2次）去除粘液和上皮细胞；3.将组织用眼科剪尽量剪碎，放入5ml含0.5mg/ml Collagenase D、0.5mg/mlDNase I、3mg/ml Dispase Ⅱ及10%胎牛血清的DMEM培养基中,37度摇床100rpm/min消化15-20分钟，将消化好的细胞悬液经200目细胞过滤筛滤过，若组织没消化完全，再重新加入消化液重复步骤3；4.细胞悬液离心300g 10min,弃上清，加入5ml DMEM重悬细胞,离心300g 10min，沉淀用8ml 40%Percoll重悬；5.取15ml离心管底部加入4ml 80%Percoll，用*头吸取细胞悬液小心铺于表面，密度梯度离心800g离心 20分钟（升速2，降速2）；6.把界面层细胞吸入新15ml离心管，加入10ml PBS，离心300g 10min,弃上清；7.再用PBS重悬后进行台盼蓝染色和细胞计数，并进行后续磁珠分离及流式分析实验。
正常情况下第5步离心后可以看到有略带乳白色的一界面层（即淋巴细胞层），而我基本看不到明显的淋巴细胞层，很困扰这是什么原因。是因为我取的是小鼠结肠组织吗，是否应该取整个肠道？消化后得到的细胞离心后再重悬时感觉很粘稠，因此加大了DNase I到3mg/ml，情况有所转，但是加入Percoll离心后还是没看到有分层。请各位大侠帮我指导一下，传授一下经验，不甚感激！！！谢谢谢谢谢谢！！！