【资源】血液涂片检测常见的染色方法

1.瑞氏染色 Wright's stain
瑞氏染色是目前最常用而又最简单的染色方法。
原理：
瑞氏试剂中之酸性伊红和碱性美篮混合经化学作用后，变成中性之 伊红化美蓝，久置后，经氧化而含有天青。此三种染料分别和细胞核及浆中的NH3+和COO-等结合，使细胞核及胞浆着色。由于系中性染料，又有缓冲液调节酸碱度，所以细胞受染后，蓝红等颜色都较适中，核染质、胞浆及其中之颗粒显色较为清楚。

瑞氏（ Wright ' sstain ；美蓝－伊红Y）染色：
1 ．瑞氏染料是由碱性染料美蓝（ Methvlem blue ）和酸性染料黄色伊红（ Eostm Y ）合称伊红美蓝染料即瑞氏 （美蓝－伊红Y）染料。 伊红钠盐的有色部分为阴离子，无色部分为阳离子，其有色部分为酸性，故称伊红为酸性染料。美蓝通常为氯盐是碱性的，美蓝的中间产物结晶为三氯化镁复盐，其有色部分为阳离子，无色部分为阴离子，恰与伊红钠盐相反。
2 ．用 甲醇作瑞氏染料溶剂，即成瑞氏染液。
甲醇是瑞氏染料良好溶剂，有两种作用：
（ 1 ）甲醇使瑞氏染料中美蓝（ M ）与伊红（ E ）在溶液中离解，可使细胞成分选择性吸附其中的有色物质而着色。甲 醇 ME （瑞氏染料）—— —— → M + + E - 在配制的瑞氏染液中美蓝如放置过久即可氧化而含有天青，美蓝天青与伊红化合物能使核染成紫红色，但不能使胞浆染为蓝色，多余美蓝就可以 使胞浆染成蓝色，染色主要是化学作用，是离子彼此结合的反应。
（ 2 ）甲醇具有强大的脱水力，可将细胞固定在一定形态及增加细胞结构的表面积，提高细胞对染料吸收作用，同时由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升温，加速染色反应。
3. 瑞氏染液配制：
(1) 瑞氏染液配制：瑞氏染料 830gm 或 1g 甲醇（ AR ） 500ml 或 600ml 先称干燥（事先放入温箱干燥过夜）瑞氏染料放置乳钵内，用乳棒轻轻 敲碎染料成粉末，再行研磨至听不到 研芝麻声 即呈细粉末，加少许甘油或甲醇溶解研磨，使染料在乳缸内显“一面镜”光泽，而无染料粉粒沉着，再加较多量甲醇研磨呈一面镜光亮，静置片刻，将上层液体倒入 一 清洁储存瓶内（最好用甲醇空瓶），再加甲醇研磨，重复数次，直至乳钵内染料及甲醇用完为止，摇匀，密封瓶口，存室温暗处，储存愈久，则染料溶解、分解就越好，一般储存 3 个月以上为佳。
(2) 缓冲液：
1) 缓冲液作用：染色对氢离子浓度是十分敏感的，据观察 pH 值的改变，可使蛋白质与染料形成的化合物重新离解。 缓冲液须保持 一定的 pH 使染色稳定， PBS 的 pH 一般在6.4~6.8 ，偏碱性染料可与缓冲液中 酸基起 中和作用，偏酸性染料则与缓冲液中的碱基起中和作用，使 pH 恒定。
2) 缓冲液配制（ pH6.4~6.8 ，弱酸性）
配方 1 ： 1% KH 2 PO 4 30ml M/15 KH 2 PO 4 73.5 ml
配方 2 ：1% Na 2 HPO 4 20ml M/15 Na 2 HPO 4 26.5ml
H2 O( 新鲜 ) 加至 1000ml 置室温黑暗处，瓶口密封，防止霉菌污染，如有污染则应报废

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2.Giemsa姬姆萨染色

姬姆萨染色简称姬氏染色，是用天青色素、伊红、次甲蓝混合而成的姬姆萨染料对血液涂抹标本、血球、疟原虫、立克次体以及骨髓细胞、脊髓细胞等标本进行染色的染色方法。
染前用蛋白酶等进行处理，然后再用姬姆萨染液染色，在染色体上，可以出现不同浓淡的横纹样着色。
姬姆萨染液可将细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色，在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。
姬姆色素染料
一种用于血液染色的混合中性染料。篮紫色粉末。应用时溶于等量的甲醇和甘油中，溶液呈蓝色。是中性染料。用作生物染色剂，如原生质的染色，特别适用于血液与血液原虫，如疟原虫等的染色。
别名：姬姆萨氏色素；吉氏色素；Azuremixture sicc. Giemsa stain
分子式：C14H14ClN3S
分子量：291.80 CAS#：51811-82-6
外观：深蓝色或黑色粉末
配法及用法
以1g的姬姆色素染料~加入66ml甘油，混匀，60度保温溶解两小时，再加入66ml甲醇混匀，即配成姬姆色素原液，
此原液用前用PBS（6.8）稀释十倍左右就可以使用。 按常规方法制备血涂片，待血膜干后,用甲醇固定 2 ～ 3 分钟；
将血涂片或骨髓涂片放置染色架上，滴加稀释好的染色液，使覆盖全部血膜，室温染色15～30分钟。
用自来水缓慢从玻片一端冲洗(注意勿先倒去染液或直接对血膜冲洗)，凉干后镜检


















3.PAS糖原染色
1、概况
PAS染色法（Periodic Acid-Schiff stain）在组织学上，主要用来检测组织中的糖类。过碘酸把糖类相邻两个碳上的羟基氧化成醛基，再用Schiff试剂和醛基反应使呈现紫红色。

2、原理
PAS染色又称过碘酸雪夫染色，糖原染色。一般用来显示糖元和其它多糖物质。
过碘酸能使细胞内的多糖乙二醇基氧化成二醛，再与Schiff氏液的无色品红结合，红色，定位于胞浆上。
3、应用
随着医学实验技术的发展，糖原染色应用的范围更加广泛，如用以证明与鉴别细胞内空泡状的性质，心肌病变及其他心血管疾病的诊断 ，糖原累积病诊断和研究 ，糖尿病的诊断和研究 ，用于某些肿瘤的诊断等。
除用于糖原的鉴定和黏液的显示外 ，还可以观察肾小球基底膜 、结肠杯状细胞中性黏液物质 、阿米巴滋养体和霉菌的着色。
4、方法
固定液
Carnoy固定液： 纯
酒精60 ml　冰醋酸10ml氯仿 30ml,也
可以选用75%酒精配制
1) 过碘酸酒清夜配法: 过碘酸(HIO .2H O) 0.4g　95%酒精 35ml　M/5醋酸钠(2.72g+蒸馏水100ml) 5ml蒸馏水10ml 保存于冰箱内,用棕色瓶,可用两周.
2)Schiff氏液: 0.5克碱性品红加入100毫升蒸馏水中,时时摇动三角瓶5分钟,使之充分溶解.冷却至50℃后过滤加入10毫升1N盐酸.冷却至25℃,加入0.5-1克偏重硫酸钠,在室温中至少静置24小时,然后密封冰箱保存.
3) Schiff氏酒精液配置　Schiff氏液 11.5ml　 1NHCI 0.5ml　 纯酒精 23ml
4) 亚硫酸水 1%偏重亚硫酸钠10ml　 1NHCI 10ml　 蒸馏水 180ml的树胶溶解。
5）哈瑞或迈耶苏木精
染色步骤
1. 石蜡切片脱蜡至水（细胞涂片，冰冻切片直接水洗）
2. 蒸馏水洗
3. 过碘酸酒清夜10min
4. 自来水冲洗10min
5. Schiff氏液10min
6. 流水冲洗5min
7.用哈瑞苏木精或迈耶苏木精染核3min(细胞核染色过深可用盐酸酒精分化）
8. 流水冲洗5min
9. 常规脱水、透明、封固

结果
PAS阳性为红色，细胞核蓝色。
4.过氧化物酶染色与铁染色
粒细胞和单核细胞胞浆内含过氧化物酶，能借助受体（联苯胺）脱氢催化过氧化化氢而释放新生氧。受体被氧化成联苯胺蓝，再与亚硝基铁氰化钠结合成稳定的蓝色颗粒而沉淀于胞浆内。
试剂
联苯胺溶液：联苯胺0.3g，加36%亚硝基铁氰化钠溶液1ml，再取95%乙醇加到100ml，水浴加热助溶。贮于棕色瓶中，可保存数月。工作时应小心溶液污染皮肤。
稀双氧水：临用前将30%双氧水用蒸馏水1∶80稀释。

操作方法
（1）新鲜干燥血片或骨髓片，加联苯胺液5～8滴，使布满整张涂片，固定1～2min。
（2）加等量稀双氧水，用吸球吹吸，使两液混匀，作用4～8min。
（3）涂片用流水冲洗，待干后再用瑞氏染液复染，复染时间约30min。
正常值
正常人群粒细胞呈阳性（胞质内含蓝绿色或棕褐色颗粒）；
单核细胞呈阴性或弱阳性；幼红细胞、浆细胞、巨核细胞、淋巴细胞呈阴性。
化验结果临床意义
对白血病诊断有意义，急性粒细胞白血病除早期原粒细胞呈阴性反应或弱阳性反应外，其余各阶段均呈阳性反应。
急性多颗粒早幼粒细胞白血病早幼粒细胞呈强阳性反应。
急性单核细胞白血病原始细胞呈阴性或弱阳性反应。
慢性粒细胞呈强阳性反应。
淋巴细胞白血病呈阴性反应。
组织细胞白血病呈阴性反应。

铁染色
人体内的铁有一定量以铁蛋白和含铁血黄素的形式贮存在骨髓中的单核-吞噬细胞胞质内，幼红细胞的线粒体中也有含铁血黄素。这些铁在酸化的低铁氰化钾溶液中反应，生成蓝色的铁氰化铁沉淀（普鲁士蓝），定位于含铁的部位。故此染色法又称为普鲁士蓝反应。

结果
1. 细胞外铁 观察骨髓小粒中贮存在单核-吞噬细胞系统内的铁（在幼红细胞之外的铁）。
阳性反应为骨髓小粒上见到的呈浅蓝绿色均匀的无形物质，或呈蓝色或深蓝色的小珠状、粗颗粒状或蓝黑色的小块物质，
按阳性反应的强度分为5级： “—” 骨髓小粒无蓝色显现（提示骨髓贮存铁缺乏）。
“1+” 有少量铁颗粒，或偶见少量铁小珠。
“2+” 有较多的铁颗粒和铁小珠。
“3+” 有很多铁颗粒、小珠和少数蓝黑色小块。
“4+” 有极多的铁颗粒和小珠，并有很多密集成堆的小块。

2. 细胞内铁 为幼红细胞内的铁。正常幼红细胞（主要是晚幼红细胞）的细胞核周围可见到1~5个呈蓝色的细小铁颗粒。含有铁颗粒的幼红细胞称为铁粒幼细胞。在油浸镜下，连续计数100个幼红细胞，记录铁粒阳性的幼红细胞数，即为铁粒幼细胞所占的百分率。需同时注意细胞内的铁粒数目、大小、染色深浅和排列。如含粗大深染的铁粒在10个以上，并环绕细胞核排列超过核周径2/3以上者，称为环状铁粒幼细胞。

3参考值
1). 细胞外铁 1+~2+，大多为2+。
2). 细胞内铁 20%~90%，平均值为65%。由于各实验室的实验条件不同，此参考值也有差异。 4临床意义 1. 缺铁性贫血时，早期骨髓中贮存铁就已耗尽，细胞外铁呈“—”。铁粒幼细胞百分率减低，常<15%，甚至为“0”。经铁剂治疗后，数天内铁小粒出现在幼红细胞中，但细胞外铁需待贫血纠正后一段时间才会出现。因此，铁染色是目前诊断缺铁性贫血及指导铁剂治疗的一项可靠和临床实用的检验方法。 2. 非缺铁性贫血如珠蛋白生成障碍性贫血、铁粒幼细胞性贫血、溶血性贫血、巨幼细胞贫血、再生障碍性贫血及骨髓病性贫血等，细胞外铁多增加，常>3+~4+。