【原创】在重庆威斯腾公司总结来的southern杂交步骤，分享给大家

这是我总结的southern blot的实验步骤，现在分享出来，大家交流一下。
一、主要仪器：
离心机
恒温水浴锅
Orbital shaker 恒温摇床
Poner PAC300核酸电泳仪
VersaDoc凝胶成像系统
水平摇床
HL-2000 Hybrilinker分子杂交仪
烘箱
二、主要材料
whatman 3mm滤纸 尼龙膜 吸水纸 玻璃板 玻璃棒 废旧胶片 方形果盘 平板
三、主要试剂
RNase A
真菌基因组提取试剂盒
DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I
DNA Maker
NaOH，NaCl，浓盐酸，Tris碱，柠檬酸钠，马来酸
四、试剂准备
变性液：0.5 mol/L NaOH，1.5 mol/L NaCl；
Southern blot中和液：0.5 mol/L Tris-HCl（pH=7.5），1.5 mol/L NaCl；
20×SSC：3 mol/L NaCl，0.3 mol/L 柠檬酸钠，浓盐酸调节pH至7.0；
2×SSC：取100 mL 20×SSC溶液，灭菌去离子水定容至1L；
2×SSC+0.01%SDS：取100 mL 20×SSC溶液，10 mL 10% SDS，灭菌去离子水定容至1L；
0.5×SSC0.01%SDS：取25 mL 20×SSC溶液，10 mL 10% SDS，灭菌去离子水定容至1L；
洗涤缓冲液：0.1 M马来酸，0.15 M NaCl，pH 7.5，0.3% （v/v） Tween 20；
马来酸缓冲液：0.1 M马来酸，0.15 M NaCl，用NaOH（固体）调节pH值至7.5；
检测缓冲液：0.1 Tris-HCl，0.1M NaCl，pH 9.5；
封阻溶液：将DIG试剂盒内的6号瓶置于37℃水浴锅中预热，充分溶解后，取12mL，与108mL马来酸缓冲液混匀备用（新鲜配制，立即使用）；
抗体溶液：将DIG试剂盒内的4号管10000rpm高速离心5min，取4?L上清，加入20mL封阻溶液中，备用；
底物显色液：取20mL检测缓冲液，避光加入400?L DIG试剂盒内的5号管。
五、实验安排
确定实验样本，查找序列，进行酶切位点及探针设计，并合成引物；
培养样本，配制杂交所用试剂，PCR探针合成，回收，质量检测，DIG标记探针；
提取样本基因组，检测基因组质量，酶切预实验；
正式酶切，电泳，转膜；
烘干固定，预杂交，杂交过夜；
洗膜，显色。
六、基因组的提取
扩大培养，磨样：
①加入400μL的LE Buffer，震荡使其充分混匀，再加入4μL的100mg/mL的RNaseA，混匀，置于65℃水浴锅中温浴半小时；
②加入130μL DA Buffer，混匀后冰浴5min后14000g高速离心3min；
③将离心后上清转移到新的1.5ml的PE管中，加入750μL E Binding Buffer，充分混匀，将混合液体转移到Spin colum中，6000g离心1min，弃去管中液体；
④向Spin colum中加入500μL G Binding Buffer，10000g高速离心30s，弃去管中液体；
⑤向Spin colum中加入600μL Wash Buffer，10000g高速离心30s，弃去管中液体；
⑥重复上一步；
⑦再次将Spin colum于10000g高速离心1min，并将Spin colum放置在一个新的1.5ml离心管上；
⑧室温静置3min，向Spin colum中加入40μL灭菌去离子水，室温放置1min，12000g高速离心1min。
检测提取得到的基因组的质量和浓度。
七、Southern blot验证敲除转化子
① 基因组酶切：
基因组双酶切，反应体系如下：

10×FD buffer	4.5 μl
酶1	2 μl
酶2	2 μl
样品DNA	6 μg
ddH2O	水至45 μl
总体积	45 μL

37℃恒温反应2 h。
② 电泳分离
酶切1.5 h后，取2μL酶切DNA样品于1%的琼脂糖凝胶上进行检测，判断酶切程度。当酶切充分时，制备1%的琼脂糖电泳凝胶，样品中加入10×loading buffer，于30-40V稳压电泳 4-5h（包括DNA Marker和阳性对照质粒），电泳完成之后，切下样品及质粒部分的凝胶，剩余DNA Marker部分则单独浸泡在添加了10 μL 10 mg/ml溴化乙锭（EB）的100 mL 1× TAE buffer中染色30 min。
③ 电泳凝胶预处理
1) 将凝胶浸于适量变性液中（浸没凝胶），室温，于水平摇床上低速晃动15 min，并重复一次；
2) 再将凝胶浸于灭菌的ddH2O中，室温，轻轻晃动10 min；
3) 将凝胶浸在中和液中，室温轻轻晃动15 min，并重复一次；
4) 在20×SSC缓冲液中平衡凝胶10 min以上。
④ 转膜
1) 裁剪一张大小合适（19cm×20cm）的whatman 3mm滤纸，经20×SSC buffer浸湿后，放在比凝胶稍大的支撑平台上，两端浸入20×SSC buffer，形成一个“桥”；
2) 将与凝胶等大的滤纸Ⅰ放在搭好桥的滤纸上，再将凝胶放置于滤纸Ⅰ上（凝胶背面向上放置），切掉左上角，注意两者之间杜绝气泡；
3) 裁剪尼龙膜，与凝胶等大，放置在凝胶上，利用玻棒使其平整，杜绝气泡出现；
4) 将三张与膜等大的whatman 3mm滤纸放在膜上，利用玻棒使其平整后，放置一叠与凝胶大小一致的吸水纸，并用玻璃板作为放置重物的平台，压在吸水纸上，再添加500 g左右的砝码；
5) 用塑料隔板封闭凝胶四周，以防止吸水纸通过接触凝胶的边缘而直接接触平板造成液流的短路，
6) 转移3小时后，将浸湿的吸水纸换掉，添加干燥的吸水纸，整个转移过程为18-24 h，期间根据吸水纸湿润情况换纸1-2次；
7) DNA在膜上的固定： 将完成转移后的尼龙膜置于2×SSC缓冲液中短暂洗涤1min，放置于两张滤纸中，120℃烘箱中烘干固定30min。
⑤ 杂交
1) 预杂交：将尼龙膜上没有固定DNA的一面贴瓶壁，放入杂交瓶中，加入42℃预热的Hyb高效杂交液（Hyb-100）(10 mL/100 mm2)，置于42℃杂交炉中预杂交2 h；
2) 标记探针：用引物TF和TR进行PCR扩增制备探针，胶回收产物，再按照DIG试剂盒的操作说明标记探针，并用PCR产物纯化试剂盒纯化探针；
3) 探针变性：将纯化后的探针沸水中水浴变性10min，立即置于冰上，冰浴2 min（现用现备）；
4) 杂交：弃去预杂交液，往杂交瓶中加入新的Hyb 高效杂交液（10 mL/100㎜2），再加入6 μL变性好的探针（5-20 ng/mL杂交液），混匀，置于杂交炉中42℃杂交过夜。
⑥ 洗膜及DIG信号检测
1) 杂交后，室温下，20 mL 2×SSC+0.1%SDS 洗膜5min，重复一次；
2) 将0.1×SSC+0.1%SDS洗液置于65℃水浴锅中预热后，加入20 mL 进杂交瓶中，65℃洗涤15 min，重复一次；
3) 将膜取出，置于平板中，加入20 mL 洗涤缓冲液中轻轻晃动5 min，倒掉液体；
4) 加入100 mL 阻断液反应30 min（在摇床上轻轻摇动），倒掉液体；
5) 加入20 mL 含有抗体的缓冲液，摇动孵育30 min后，倒掉液体；
6) 再加入100 mL洗涤缓冲液洗涤15 min，倒掉液体后，重复此步骤一次；
7) 加入20 mL检测缓冲液，平衡5分钟；
8) 将膜放在盛有底物显色液的盒中（10 mL显色液/100 mm2），15-25℃避光孵育3-5h；
9) 当显色到适合的效果后用水洗膜5min，扫描结果。