来分享啦｜Real-time PCR 实验攻略

最近看到园子里很多小伙伴关于 Real-time PCR 实验还是有些问题，这不是马上赶来给大家分享了吗！完整实验步骤奉上～

一、材料

RT-96 孔板或 RT-8 连管 引物 反转录试剂 RT-检测试剂 双蒸水 离心机 RT-PCR 仪

二、步骤

1.基因组 DNA 的去除。一般现在的反转录试剂都配备了 DNA 酶，来去除 RNA 样品中混有的基因组 DNA，避免后续检测过程中基因组 DNA 可能对检测的影响。通常取 0.5-1μg RNA 样品，按照试剂中的反应条件，去除基因组 DNA。

2. RNA 反转录。按照试剂盒的说明，在上述体系中加入相应的酶等成分，进行反转录。

3.转录产物的稀释。PCR 检测程序中，产物都是以指数增长的，反转录得到的体系较少，有的时候同一个样品需要检测多个基因的表达情况，为了加样的准确性，一般会将转录产物进行稀释，通常情况下将转录产物稀释 5-10 倍。

4.PCR 上样检测。通常的，为了减少误差，会先将同种成分配制成一个体系，再分装至 8 连管或 96 孔板中，如：检测试剂（包含酶、探针、buffer、离子等）、前后引物、水等可以配制在一起，最后再往孔中加入对应的反转录产物。加样完成后，上机检测。

5.下机，分析数据。

三、常见问题

（一）样品间的差异大

1.首先看是不是该基因的含量低，一般 30 循环以上含量就较低了，会导致孔之间的差异大，如果一定需要检测，可以尝试减小反转录产物的稀释倍数；

2.加样不均匀，极容易发生在加 DNA 模板的时候，枪头中的样品打的不干净；

3.相同的成分可以配制好体系混匀之后，再加样。

（二）每一对新引物，第一次用的时候都建议做一个阴性对照，检查该引物的特异性。

以上内容是我在丁香实验小程序里看到的经验～就在【丁香实验-Realtime（qPCR）实验进阶】这个专题里，如果想看更多教学视频或者文字 balabala可以看下面评论区～任何人不点一下看看我都会伤心的 ok？