【求助】两幅共聚焦图片请教各位前辈，致谢

本人近期对一段组织（厚约1mm）做了一次共聚焦，因以前没做组织方面的经验，不知此图片中的背景是否正常，个人感觉背景有点深，但又不确定。请有此方面经验的老师帮忙分析一下，万分感谢。

具体操作如下：

1.4%多聚甲醛固定了四天（因初次预定的观察日期推迟致使多固定了几天）。

2.pbs-Tween洗5次x5min（所有清洗过程均在24孔板中进行，每次用量为2ml）

3.二抗同源血清、1%BSA 0.5%Triton RT封闭1h

4.1%BSA 0.1%Triron PBS中孵育一抗湿盒4度过夜

5.0.1%Triton PBS-Tween 洗5次x10min

6.0.1%Triton TR标记的二抗湿盒中RT 1h

7.PBS-Tween 洗5次x10min

8. 防焠灭剂封片4度保存第二天共聚焦观察

一、二抗和防淬灭剂均来自scrus，应用浓度为其推荐浓度。操作中戴手套、口罩，载玻片、盖玻片均泡过酸清洗。
另外，原本准备了三个标本，因第一次做没有经验，电镜室的老师找了将近一个小时才初步摸索好各种参数，第一个标本就花了2小时。此段时间，另外两个标本一直放于旁边待用，但当观察完第一个、再看第二个标本时，相同参数下却找不到任何荧光点，刚开始以为标本没做好，但换用第三个标本同样未发现任何荧光。当时我看到房间温度计显示20摄氏度，怀疑是温度所致，将标本置于冰箱中冷却后再次观察果然成功观察到了目标物，但荧光强度却明显低于第一个标本。所有标本于镜下观察前一直避光，现在看来温度对荧光还是有一定影响的。所以想通过自身的教训提醒各位同道以后做共聚焦时也别忽视了温度的影响.....

好了，小弟在此期待着各位前辈对此图的评价，如果确为背景过深，还恳请各位前辈提点建议、留下金言。小弟在此谢过啦

下图是同一标本不同深度的图像（图中未见目标物质，隐约可见细胞影，周围背景无显著变化）：