【求助】红色荧光蛋白稳定转染
RFP载体在包装细胞中的生成:为了逆转录病毒的转导需要PT67,一种NIH3T3来源的表达10AL的病毒envelope包装细胞系。PT67培养在含10%热灭活胎牛血清的DME中。为了使载体产生,包装细胞PT67在长到70%时与DOTAP试剂和足量pLNCX-DsRed2质粒的混合物孵育18小时。此时装满新鲜的培养基。转染48小时后,细胞用荧光显微镜检测。筛选,细胞在含有500到2000ug/mLG418中培养(7天里逐步增加)。
肿瘤细胞系的RFP基因转导:RFP基因转导,20%的人的肿瘤细胞与PT67细胞逆转录病毒的上清混合物(precipiated mixture)(1:1)在10%胎牛的1640中共同孵育72小时。此时装满新鲜培养基。肿瘤细胞用胰酶/EDTA 消化收集,然后以1:15的比例接种到含50ug/mLG418的选择性培养基中。G418的水平逐步增加到800ug/mLRFP的克隆表达用克隆柱分离通过胰酶/EDTA并在没有选择剂的条件下常规培养扩增。