组织&细胞RNA提取

1 背景知识介绍

1.1 为什么先发现DNA而不是RNA？

RNA不稳定的原因主要有个：（1）一般来说，由于化学的原因，RNA是不稳定的；（2）RNA通常只有一条单链，而DNA是双链，因此RNA更脆弱，容易分解，因为它含有核糖（ribose sugars）而不是脱氧（deoxyribose）核糖碳水化合物；（3）RNA是由核糖碳水化合物而不是脱氧核糖构成的；（4）由于羟基（hydroxyl group）的存在，它比DNA更不稳定，这使得它更容易被水解和破坏；（5）DNA中缺乏这种羟基基团(也称为2'-脱氧核糖核酸)是很重要的，由于RNA具有典型的2'羟基，因此磷酸二酯键不稳定，容易遭受亲核攻击（nucleophilic assault）和自水解。

（图1 RNA自身化学结构不稳定的因素示意图）

1.2 无所不在的RNase

RNase在核酸代谢中起着重要作用，存在于原核生物和真核生物中，几乎存在于每一种细胞类型中。人体利用通过在眼泪、唾液、粘液和汗液中分泌这些酶来抵御入侵微生物的酶 [1]。核糖核酸也存在于剥落的皮肤、可能掉落在长凳上的毛发以及可能粘在衣服上的宠物毛发中[2]。RNase，特别是那些属于RNase A家族的，是相当小的，紧凑的蛋白质，含有几个半胱氨酸残基，形成许多分子内二硫键，这种简单的结构，在没有变性剂的情况下，变性RNase在冷却到室温后往往会恢复其原有的结构和部分功能。因此，RNase在冻融循环甚至高压灭菌后仍能保持大量活性 [3-4]。因此，在提取RNA过程中，没有很好注重消除RNase的影响，往往导致RNA在浓度，纯度，抗降解等方面有副作用。

2 细胞/组织/血液中RNA提取实操

2.1 RNA提取概述

从细胞/组织/血液中RNA提取，主要包含的步骤有：首先获得样品，并充分捣碎（组织），然后加入适量Trizol试剂（本文使用1ml为例，进行讲解），接着加入氯仿（氯仿的主要目的是加速有机相和水相的分层，RNA 仅存在于上层水相，回收水相可将蛋白与 RNA 分离），接着通过4℃离心，可将RNA萃取到水相层（最上边），使用1/2 Trizol体积的异丙醇 （异丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一样，但RNA具有更强的“抢水能力”，异丙醇羟基具有更强的亲水性，换句话说就是抢走RNA结合的水分子，而使得RNA沉淀/析出），然后使用75%和100%乙醇对RNA进行洗涤和干燥，最后使用适量的DEPC水溶解RNA（6孔板细胞一般用20-30μL DEPC水溶解）,可参考图2 RNA提取一览过程示意图.

（图2 RNA提取实操步骤总括）

 2.2 RNA提取

（A）试剂准备

Trizol试剂、氯仿（三氯甲烷）、异丙醇、75%乙醇、无水乙醇、液氮（研磨组织）、细胞/组织。

（B）仪器耗材

 4℃高速离心机、研钵（组织）、1.5ml EP管、200μL EP管、PE手套、移液枪、移液枪头、RNA提取操作台。

（C）总RNA提取步骤

（1）加入1ml Trizol裂解液（6孔板<30mm>，3ml-6cm，8ml-10cm），充分裂解细胞/研磨好的组织（可剧烈晃动），静置5分钟左右（利于彻底裂解蛋白质）；

（2）加入200μL 氯仿（chloroform）<200μl 对应1ml Trizol试剂>，剧烈震荡15秒后，静置10-15分钟；

（3）4℃ 12,000rpm离心 15分钟（离心后会分层，其中RNA在水相层）；

（4）将水相层中的RNA转移至新的1.5 ml EP管中（大概400Μl,千万不能贪心），加入0.5倍体积的异丙醇（isopropanol）<isopropanol ： Trizol= 0.5:1>，充分混匀后室温孵育10分钟，有的实验室也在4℃充分沉淀2h，甚至过夜沉淀；

（5）4℃ 12,000rpm 离心10分钟，此步骤会得到RNA白色沉淀于EP管底部；

（6）1ml 75%乙醇洗涤RNA（RNA可保存在75%乙醇-20℃至少1年，4℃至少一周）；

（7）4℃ 7500rpm 离心5分钟；

（8）加入1ml 无水乙醇洗涤RNA沉淀，可以加速RNA中残留的液体（可选）；

（9）在RNA提取操作台中，充分让RNA中的液体被蒸发，保持RNA 的干燥；

（10）利用50-100μl DEPC H₂O，重悬RNA沉淀，后于紫外分光光度仪测量RNA 的浓度或电泳检测完整性。

3 RNA浓度纯度和完整性检测

OD: optical density，OD260 是核酸吸收的最高峰，OD280是蛋白质吸收的最高峰；

OD230 表示样品存在的一些污染，例如碳水化合物、盐（胍盐），较纯净的核酸A230/A260比值大于2.0；260 nm处1 OD吸光值 相当于50 g/ml 双链DNA,37 g/ml单链DNA,40 g/ml RNA 或30 g/ml寡核苷酸。

DNA：OD260:OD280=1.6-1.8(1.8 纯DNA)，低于此范围表示蛋白超标，高于此范围表示存在RNA；

RNA：OD260:OD280=1.6-2.2(2.0纯RNA)，RNA是单链，在紫外吸收会比DNA双链高；

4 电泳RNA完整性检测

哺乳动物RNA电泳条带是3条，28s、18s、5s（28s一般是18s亮度的两倍，5s几乎看不见，如果较多说明RNA降解。）电泳液必须是新的，且不含有RNA酶。

（图3 RNA电泳）

 5 结束。

参考

[1] Gupta SK, Haigh BJ, Griffin FJ, Wheeler TT. The mammalian secreted RNases: mechanisms of action in host defence. Innate Immun. 2013 Feb;19(1):86-97. doi: 10.1177/1753425912446955. Epub 2012 May 23. PMID: 22627784.

[2] Zasloff M. Antimicrobial RNases of human skin. J Invest Dermatol. 2009 Sep;129(9):2091-3. doi: 10.1038/jid.2009.216. PMID: 19809422.

[3] Klink TA, Woycechowsky KJ, Taylor KM, Raines RT. Contribution of disulfide bonds to the conformational stability and catalytic activity of ribonuclease A. Eur J Biochem. 2000 Jan;267(2):566-72. doi: 10.1046/j.1432-1327.2000.01037.x. PMID: 10632727.

[4] Miyamoto T, Okano S, Kasai N. Irreversible thermoinactivation of ribonuclease-A by soft-hydrothermal processing. Biotechnol Prog. 2009 Nov-Dec;25(6):1678-85. doi: 10.1002/btpr.267. PMID: 19725109.