【专题】TFAR19 促进小鼠肝线粒体膜通透性转运孔的开放（本人参与的实验）
发布于 2004-06-27 · 浏览 4307 · IP 江西江西
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TFAR19 促进小鼠肝线粒体膜通透性转运孔的开放
摘要 T FA R19 基因( TF21 cell apoptosis related gene 19) 是北京大学人类疾病基因中心从人白血病细胞株TF21细胞中克隆到的凋亡相关新基因之一( GenBank 登记号AF014955) 。初步研究发现, 该基因在细胞凋亡时高表达,并且表达产物具有抑制肿瘤细胞生长和促进凋亡作用。但是其确切的作用机制不明。线粒体膜完整性破坏所导致促凋亡因子(如细胞色素c 等因子) 的释放是细胞凋亡关键性的控制因素。线粒体膜通透性转运孔( PTP) , 对线粒体膜完整性具有重要的调控作用。研究了重组人TFAR19 蛋白在体外条件下, 对线粒体PTP、跨膜电位, 以及细胞色素c 释放的影响。结果表明, TFAR19 蛋白使分离的小鼠肝线粒体PTP 开放、线粒体跨膜电位下降, 以及细胞色素c 释放。TFAR19 对线粒体的上述作用是通过促进PTP 开放起作用的。实验结果提示, TFAR19 对线粒体凋亡信号有正反馈放大作用, 并进一步揭示了TFAR19 促进细胞凋亡的机制。
关键词 凋亡; TFAR19 ; 线粒体; 跨膜电位; 膜通透性转运孔(PTP)
T FA R19 基因( TF-1 cell apoptosis related gene19) 是北京大学人类疾病基因中心从人白血病细胞株TF-1 细胞中克隆到的凋亡相关新基因之一GenBank 登记号AF014955) [1 , 2 ] 。初步的研究表明, 不同方式(包括细胞毒药物和Fas 受体活化) 诱导细胞凋亡过程中, T FA R19 基因的mRNA 水平及蛋白质表达均明显增高[1～3 ] 。纯化的TFAR19 重组蛋白可加速TF21 细胞去细胞因子所致的凋亡;能促进人滑膜细胞凋亡[1 ] ; 对γ射线诱导MCF27细胞凋亡有促进作用[4 ] ; 对撤血清诱导的HL260 细胞凋亡有促进作用[5 ] , 但是其确切的作用机制不明。线粒体不仅仅是细胞内的能量工厂, 而且在决定细胞生存或死亡方面也起到非常重要的作用。线粒体损伤可能是细胞凋亡发生的启动点, 而靶就是线粒体膜上的通透性转运孔(permeability t ransitionpore , PTP) [6 , 7 ] 。本文旨在研究重组TFAR19 蛋白质在体外条件下, 对小鼠肝离体线粒体功能和线粒
体PTP 状态的影响, 并对其促进凋亡的机制进行了探讨。
1 材料和方法(Materials and Methods)
1. 1 试剂
TFAR19 蛋白质由北京大学医学部人类疾病基因中心提供。去脂牛血清白蛋白(BSA) 、ADP、CC2CP、环胞菌素A 和罗丹明123 ; 鱼藤酮( rotenone)为Sigma 产品。蔗糖和IPTG 购于Life Technolo2gies 。Triton X2100 和HEPES 为Merck 公司产品。谷胱甘肽琼脂糖( glutathione2Sepharose 4B ) 为Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala , Sweden) 的产品。细胞色素c 单抗购于BD PharMingen 公司。带人全长Bcl2xL 基因的p GEX22TK 表达载体由Tsujimoto 博士(Osaka University , J apan ) 馈赠。其他试剂均为国产分析纯。
1. 2 肝脏线粒体的提取
健康雄性Balb/ c 小鼠(20～25 g) 颈椎脱臼处死, 迅速取出肝脏, 剪碎, 用电动匀浆器匀浆。介质为250 mmol/ L 蔗糖、2 mmol/ L HEPES ( pH7. 4) 、0. 1 mmol/ L EDTA 和0. 1 %牛血清白蛋白。差速离心法分离线粒体[8 , 9 ] 。匀浆物经600 g 离心10 min 后, 上清液转入到新的离心管中。再经10 000 g 离心10 min , 弃上清液, 沉淀用介质洗2遍。所得沉淀即为提取的线粒体, 用介质稀释到合
适浓度备用。以上所有操作均于4 ℃条件下进行。线粒体蛋白质含量用双缩脲法测定, 用280 nm 下校正的BSA 作标准。
1. 3 表达和纯化重组蛋白质
首先将带有人全长Bcl2xL 基因的载体转入大肠杆菌DH5α中, 然后用0. 1 mmol/ L的IPTG在37 ℃诱导4～6 h 。诱导后的细菌经离心沉淀, 并被弗氏(French) 细胞破碎仪于4 ℃下裂解。裂解缓冲液为PBS (含1 mmol/ L DTT、1 %Triton X2100 、1 mmol/ L PMSF , pH 7. 4) 。然后将细胞裂解物在10 000 g 下离心10 min。把上清液装载到谷胱甘肽琼脂糖柱上, 然后用PBS 冲洗柱子。最后用50 mmol/ L Tris2HCl 溶液(含10 mmol/ L 还原型谷胱甘肽, pH 8. 0) 洗脱结合到柱子上的GST2Bcl2xL , 并收集蛋白质。纯化的蛋白质经超滤浓缩后, 溶解于20 mmol/ L HEPES ( 含1 mmol/ LDTT , pH 7. 4) 溶液中[10 , 11 ] 。根据波长280 nm 处的紫外吸收定量蛋白质。
1. 4 线粒体膜通透性转运孔( PTP) 的检测
线粒体肿胀是PTP 开放的直接结果, 因此测定线粒体体积变化可以直接反映PTP 是否开放。根据90°光散射下降的方法检测线粒体肿胀程度[12 ] 。石英杯中加入3 mL 测定介质P (250 mmol/L 蔗糖、2 mmol/ L HEPES , pH 7. 4 、0. 5 mmol/ LKH2PO4 和4. 2 mmol/ L 琥珀酸盐) , 然后加入一定量的线粒体。使用荧光分光光度计(Jobin2YvonFluoroMax22) 测定线粒体悬浮液90°光散射值强度。发射和激发波长均为520 nm。测定温度为25℃。受试物于图中箭头所示位置加入。当需要观察抑制剂的作用时, 抑制剂在加入线粒体之前预先加到体系中。
1. 5 线粒体跨膜电位(ΔΨm) 的测定
荧光探针罗丹明123 (Rh123) 作为线粒体跨膜电位的指示剂, 根据ΔΨm 依赖的Rh123 线粒体摄入情况, 用荧光分光光度计(Jobin2Yvon Fluoro2Max22) 测定线粒体跨膜电位的变化[10 , 13 ] 。石英杯中加入3 mL 测定介质P (同上) , 然后分别加入一定量的线粒体和Rh123 (终浓度30 nmol/ L) , 保温一定时间后检测Rh123 荧光强度变化。Rh123 的激发波长为505 nm , 发射波长为534 nm。测定温度为25 ℃。受试物于图中箭头所示位置加入。
1. 6 Western 印迹分析细胞色素c 的释放
分离的线粒体与TFAR19 蛋白质在室温下温育15 min。如需抑制剂时, 抑制剂先与线粒体温育5 min , 然后再加入TFAR19 蛋白。温育介质为介质P(同上) 。然后将线粒体悬浮液于4 ℃, 12 000 g离心10 min , 收集上清液。经聚丙烯酰胺凝胶电泳(12 %) 分离上清液中的蛋白质, 150 V 电泳至溴酚蓝到达凝胶底部为止。上样前样品与SDS 上样缓冲液混合, 于100 ℃煮沸3 min , 电泳完毕后, 使用转移槽将经凝胶分离的蛋白质转移至PVDF 膜上,150 mA 电转移2 h 。转移好的膜用封闭液25 ℃振荡封闭0. 5 h , 然后与抗细胞色素c 单克隆抗体振荡温育过夜。倾去一抗后, 再与二抗振荡温育2 h 。然后用碱性磷酸酶显色试剂盒显色[6 ] 。
2 结果(Results)
2. 1 TFAR19 蛋白质诱导线粒体PTP 缓慢开放线粒体肿胀是PTP 开放的直接结果, 因此测定线粒体肿胀可以直接反映PTP 是否开放[6 , 7 ] 。线粒体肿胀导致线粒体透射光增多, 散射光减少。我们发现, 10 mg/ L 的TFAR19 蛋白质加入到线粒体悬浮液中, 引起线粒体悬浮液的90°光散射缓慢下降, 说明10 mg/ L 的TFAR19 蛋白质能够缓慢引起线粒体PTP 的开放, 且呈现量效关系(图1) 。PTP 的抑制剂环胞菌素A (CsA) 和Bcl2xL 能抑制TFAR19 引起的线粒体肿胀(图2) 。
Fig. 1 TFAR19 induced mitochondrial swelling
Mitochondrial swelling was monitored spectrometrically at 1 g/ L by thedecrease of 90°light scatter at 520 nm. Trace b , c and d , TFAR19 protein(1 mg/ L , 5 mg/ L and 10 mg/ L) was added respectively as indicated ; trace a was control , mitochondria only without additions.
Fig. 2 The effects of Bcl2xL and CsA on mitochondrialswelling induced by TFAR19
Mitochondrial swelling was monitored spectrometrically at 1 g/ L by the decrease of 90°light scatter at 520 nm. Trace b and trace c , CsA(1μmol/ L) and Bcl2xL (16 mg/ L) respectively was first incubated withthe mitochondira , then TFAR19 ( 10 mg/ L ) was added as indicated ;trace d , TFAR19 protein (10 mg/ L) was added as indicated ; trace a was control , mitochondria only without additions..
2. 2 TFAR19 蛋白质使线粒体跨膜电位(ΔΨm) 下降PTP 开放会引起线粒体跨膜电位(ΔΨm) 的崩溃[14 ] 。罗丹明123 (Rh123) 是阳离子染料, 能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体基质, 而使其荧光猝灭。线粒体跨膜电位丧失后, Rh123 重新释放出线粒体, 从而发出荧光[13 ] , 以跨膜电位生成后加入解偶联剂CCCP 使荧光强度上升程度作为正常跨膜电位的量度, 表明TFAR19 可以诱导线粒体膜电位的下降; Bcl2xL 和CsA 也能够阻止TFAR19 引起的线粒体膜电位的下降(图3) 。
Fig. 3 Loss of the isolated mitochondrial membrane potentialinduced by TFAR19 , and the effects of Bcl2xL and CsAIsolated mitochondria ( 1 g/ L) were incubated at 25 ℃ in the mediumcontaining 250 mmol/ L sucrose , 2 mmol/ L HEPES (pH 7. 4) , 0. 5
mmol/ L KH2PO4 , 2μmol/ L rotenone and 4. 2 mmol/ L potassium succinate to energize mitochondria. ΔΨm was assessed by measuring the membrane potential dependent uptake of rhodamine 123 ( Rh123) with excitation at 500 nm and emission at 530 nm after addition of 30 nmol/L Rh123 to the mitochondria suspension. Trace a , TFAR19 (10 mg/ L)was added as indicated ; trace b and c , CsA(1μmol/ L) , Bcl2xL (16 mg/L)
respectively was first incubated with the mitochondira , then TFAR19(10 mg/ L) was
dded as indicated , trace d was control , mitochondria only without additions. CCCP (uncoupling agent , 3 μmol/ L) was used as internal control in all the experiment .
Fig. 4 The release of cytochrome c from isolated mitochondria induced by TFAR19
Isolated mitochondria (1 g/ L) were treated for 25 min at 25 ℃with recombinant TFAR19 (10 mg/ L) or in the presence of Bcl2xL or CsA in the medium containing 250 mmol/ L sucrose , 2 mmol/ L HEPES (pH7. 4) , 0. 5 mmol/ L KH2PO4 , 2 μmol/ L rotenone and 4. 2 mmol/ L potassium succinate. After incubation , mitochondria suspension was
centrifuge at 12 000 g for 5 min. The presence of cytochrome c in mitochondrial supernatants was assessed by immunoblot analysis. Lane 1 ,negative control ( supernatant of untreated mitochondria) ; lane 2 , positive control (pellet of untreated mitochondria) ; lane 3 and lane 4 , Bcl2xL(16 mg/ L) and CsA ( 1 μmol/ L) were preincubated with mitochondria before TFAR19 (10 mg/ L) was added ; lane 5 , TFAR19 (10 mg/ L) .
2. 3 TFAR19 引起线粒体释放细胞色素c
细胞色素c 是胱冬肽酶29 (caspase29) 激活的辅助因子。已经证明, 细胞色素c 从线粒体膜间隙释放是PTP 开放的直接结果[15 , 16 ] 。我们的结果证
明, 10 mg/ L TFAR19 能诱导细胞色素c 释放。环胞菌素A、Bcl2xL 能抑制TFAR19 引起的线粒体细胞色素c 释放(图4) 。
3 讨论(Discussion)
T FA R19 基因是北京大学人类疾病基因中心从人白血病细胞株TF21 细胞中克隆到的新的凋亡相关基因。基因全长559 bp , 编码125 个氨基酸,mRNA 斑点杂交显示TRA R19 在许多组织中有表达, 但是在胚胎的表达远少于成体。初步的研究发现, 该基因在细胞凋亡时高表达, 其表达产物具有抑制肿瘤细胞生长和促进凋亡作用[1～3 ] 。重组的人TFAR19 蛋白对撤除细胞因子的HL260 细胞具有明显的促凋亡效应[5 ] ; 对γ射线诱导MCF27 细胞凋亡有促进作用[4 ] ; 对羟基喜树碱诱导人7721 肝癌细胞凋亡有增敏作用[17 ] 。但是, 其如何发挥促进凋亡和抑制增殖效应的确切作用机制还不清楚。最近的研究表明, 线粒体在凋亡过程中起重要的调节作用。线粒体膜通透性改变可能是细胞死亡的关键性机制[18 ] 。线粒体通透性转运孔( PTP) 的开放能够导致线粒体跨膜电位(ΔΨm) 的崩溃、胱冬肽酶(caspases) 活化和凋亡诱导因子〔细胞色素c 、凋亡诱导因子(AIF) 、Smac/ DIABLO 等〕的释放、ATP 生成减少、以及有时由于氧的不完全氧化导致的氧自由基的产生增加[19～21 ] 。本研究显示, 在体外条件下, TFAR19 可以直接作用于鼠肝线粒体, 导致其功能受损, 包括线粒体通透性转运孔( PTP) 开放、跨膜电位(ΔΨm) 丧失、以及细胞色素c 释放。TFAR19 可以直接作用于线粒体, 使其PTP缓慢的开放, 导致线粒体肿胀, 90°光散射下降。这种作用可以被CsA 和Bcl2xL 抑制。PTP 的生理作用目前还不清楚, 它可能参与细胞内钙稳态的调控及生理性钙振荡, 同时可能防止线粒体钙超载; 它还可能参与ATP/ ADP 的转运和能量代谢[22 , 23 ] 。另外, 作为许多生理效应〔包括电压、二价阳离子、线粒体基质pH、氧化还原状态、ADP、ATP、一些代谢产物(葡萄糖、肌酸、泛醌) 等〕的感受器[16 ] ，PTP 整合了电生理、氧化还原状态与细胞代谢状态的信息。因此, PTP 在维持线粒体和细胞的正常的生理功能方面起非常重要的作用。线粒体膜通透性1 8 2 May , 2002 田辉凯等: TFAR19 促进小鼠肝线粒体膜通透性转运孔的开放改变, 主要是指内膜的通透性突然的升高。正常情况下, 线粒体外膜上的电压依赖性阴离子通道
(voltage2dependent anion channel , VDAC) 可以允许分子量5 kD 以下的分子通透, 使得呼吸链底物(如NADH、FADH 和ADP/ ATP 等) 能够在细胞质和线粒体间隙之间自由交换。相反, 线粒体内膜几乎是没有通透性的, 以维持跨内膜的电化学质子梯度,保证线粒体呼吸链的正常运转。PTP 的开放有两种状态: 一种是低电导性(low conductance) 通道, 直径约为1. 8 nm , 这是一种短暂和可逆的开放, 可能参与钙离子的释放或ADP 的转运; 另外一种为高电导性(high conductance) 通道, 直径约为2. 5～3. 0nm , 这是一种病理性的不可逆开放, 可以导致细胞凋亡或死亡[22～24 ] 。我们这里指的PTP 开放主要指后一种。PTP 开放可以使分子量高于1. 5 kD 的物质进入线粒体基质, 导致线粒体肿胀。随着线粒体的肿胀, 折叠的内膜逐渐打开, 最终导致线粒体外膜胀破, 使得线粒体间隙内促凋亡因子释放[14 , 25 ] 。TFAR19 诱导线粒体膜电位下降, 导致跨膜电位(ΔΨm) 崩溃。Bcl2xL 和CsA 均可以抑制TFAR19引起的线粒体膜电位下降我们知道, 电子经呼吸链传递的同时, 将质子从线粒体内膜的基质侧泵到内膜外, 线粒体内膜不允许质子回流, 因此造成膜内外的电化学梯度, 这里既有H+ 浓度的梯度, 又有跨膜电位差, 这种电化学梯度的形成可以看作能量的储存, 当质子顺梯度回流时则驱动ADP 与Pi合成ATP。而TFAR19 可能通过作用于PTP 使其开放, 使质子回流来介导线粒体膜电位的下降, 致使线粒体合成ATP 受阻。使细胞能量的供给发生危机, 促进细胞凋亡。
CsA 与基质中的亲环蛋白D (cyclophilin D) 结合, 高效特异地抑制线粒体PTP 的开放[26 , 27 ] 。亲环蛋白D 是基质中的肽基2脯氨酰基顺反异构酶,通过与PTP 组分中的腺苷酸转位蛋白(adenine neucleotide t ranslocator , ANT) 直接作用行使功能。当CsA 与亲环蛋白D 结合后, 亲环蛋白D 与PTP 中的ANT 的结合位点分离, 使PTP 开放受到抑制。Bcl2xL 属于Bcl22 家族, 主要锚定于线粒体外膜上,
它可以在内外膜接触处插入内膜与ANT 作用[28 , 29 ] 。这两种抑制剂, 均能抑制TFAR19 的作用, 提示TFAR19 可能直接作用于PTP , 使其开放, 但是也不能完全排除通过其他机制间接作用于PTP 的可能性。这方面还有待于进一步的研究。最新的研究结果显示[30 ] , 在不同的因素诱导细胞凋凋亡过程中, TFAR19 均高表达于细胞质,然后出现核转位现象。核转位现象早于磷脂酰丝氨
酸(phosphatidylserine , PS) 外翻, 平行于线粒体的膜电位下降。属于凋亡的早期事件。提示, TFAR19的胞质中的高表达早于线粒体的膜电位下降, 应该处于线粒体功能受损伤的上游, 然后才出现TFAR19 核转位现象。结合本试验的结果, 推测TFAR19 在高表达于胞质的过程中作用于线粒体,使线粒体的功能受损。但是, 关于凋亡过程中的T FA R19 的核转位现象以及与凋亡的关系的意义还不清楚, 需要进一步的研究。
基于上述实验结果和相关文献报道可以初步得出这样一个结论, TFAR19 对细胞凋亡的促进作用是一种正反馈放大效应, 细胞接受各种凋亡信号,开始决定走向凋亡, 初期激活T FA R19 基因, 使其高表达, 表达产物再反过来作用于线粒体, 使其PTP 开放, 跨膜电位崩溃, 肿胀, 释放细胞色素c等凋亡因子, 从而放大凋亡信号, 形成正反馈放大环路, 促进细胞凋亡的发生发展。这应是TFAR19
对细胞凋亡的促进作用的生理意义所在。
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体PTP 状态的影响, 并对其促进凋亡的机制进行了探讨。
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TFAR19 蛋白质由北京大学医学部人类疾病基因中心提供。去脂牛血清白蛋白(BSA) 、ADP、CC2CP、环胞菌素A 和罗丹明123 ; 鱼藤酮( rotenone)为Sigma 产品。蔗糖和IPTG 购于Life Technolo2gies 。Triton X2100 和HEPES 为Merck 公司产品。谷胱甘肽琼脂糖( glutathione2Sepharose 4B ) 为Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala , Sweden) 的产品。细胞色素c 单抗购于BD PharMingen 公司。带人全长Bcl2xL 基因的p GEX22TK 表达载体由Tsujimoto 博士(Osaka University , J apan ) 馈赠。其他试剂均为国产分析纯。
1. 2 肝脏线粒体的提取
健康雄性Balb/ c 小鼠(20～25 g) 颈椎脱臼处死, 迅速取出肝脏, 剪碎, 用电动匀浆器匀浆。介质为250 mmol/ L 蔗糖、2 mmol/ L HEPES ( pH7. 4) 、0. 1 mmol/ L EDTA 和0. 1 %牛血清白蛋白。差速离心法分离线粒体[8 , 9 ] 。匀浆物经600 g 离心10 min 后, 上清液转入到新的离心管中。再经10 000 g 离心10 min , 弃上清液, 沉淀用介质洗2遍。所得沉淀即为提取的线粒体, 用介质稀释到合
适浓度备用。以上所有操作均于4 ℃条件下进行。线粒体蛋白质含量用双缩脲法测定, 用280 nm 下校正的BSA 作标准。
1. 3 表达和纯化重组蛋白质
首先将带有人全长Bcl2xL 基因的载体转入大肠杆菌DH5α中, 然后用0. 1 mmol/ L的IPTG在37 ℃诱导4～6 h 。诱导后的细菌经离心沉淀, 并被弗氏(French) 细胞破碎仪于4 ℃下裂解。裂解缓冲液为PBS (含1 mmol/ L DTT、1 %Triton X2100 、1 mmol/ L PMSF , pH 7. 4) 。然后将细胞裂解物在10 000 g 下离心10 min。把上清液装载到谷胱甘肽琼脂糖柱上, 然后用PBS 冲洗柱子。最后用50 mmol/ L Tris2HCl 溶液(含10 mmol/ L 还原型谷胱甘肽, pH 8. 0) 洗脱结合到柱子上的GST2Bcl2xL , 并收集蛋白质。纯化的蛋白质经超滤浓缩后, 溶解于20 mmol/ L HEPES ( 含1 mmol/ LDTT , pH 7. 4) 溶液中[10 , 11 ] 。根据波长280 nm 处的紫外吸收定量蛋白质。
1. 4 线粒体膜通透性转运孔( PTP) 的检测
线粒体肿胀是PTP 开放的直接结果, 因此测定线粒体体积变化可以直接反映PTP 是否开放。根据90°光散射下降的方法检测线粒体肿胀程度[12 ] 。石英杯中加入3 mL 测定介质P (250 mmol/L 蔗糖、2 mmol/ L HEPES , pH 7. 4 、0. 5 mmol/ LKH2PO4 和4. 2 mmol/ L 琥珀酸盐) , 然后加入一定量的线粒体。使用荧光分光光度计(Jobin2YvonFluoroMax22) 测定线粒体悬浮液90°光散射值强度。发射和激发波长均为520 nm。测定温度为25℃。受试物于图中箭头所示位置加入。当需要观察抑制剂的作用时, 抑制剂在加入线粒体之前预先加到体系中。
1. 5 线粒体跨膜电位(ΔΨm) 的测定
荧光探针罗丹明123 (Rh123) 作为线粒体跨膜电位的指示剂, 根据ΔΨm 依赖的Rh123 线粒体摄入情况, 用荧光分光光度计(Jobin2Yvon Fluoro2Max22) 测定线粒体跨膜电位的变化[10 , 13 ] 。石英杯中加入3 mL 测定介质P (同上) , 然后分别加入一定量的线粒体和Rh123 (终浓度30 nmol/ L) , 保温一定时间后检测Rh123 荧光强度变化。Rh123 的激发波长为505 nm , 发射波长为534 nm。测定温度为25 ℃。受试物于图中箭头所示位置加入。
1. 6 Western 印迹分析细胞色素c 的释放
分离的线粒体与TFAR19 蛋白质在室温下温育15 min。如需抑制剂时, 抑制剂先与线粒体温育5 min , 然后再加入TFAR19 蛋白。温育介质为介质P(同上) 。然后将线粒体悬浮液于4 ℃, 12 000 g离心10 min , 收集上清液。经聚丙烯酰胺凝胶电泳(12 %) 分离上清液中的蛋白质, 150 V 电泳至溴酚蓝到达凝胶底部为止。上样前样品与SDS 上样缓冲液混合, 于100 ℃煮沸3 min , 电泳完毕后, 使用转移槽将经凝胶分离的蛋白质转移至PVDF 膜上,150 mA 电转移2 h 。转移好的膜用封闭液25 ℃振荡封闭0. 5 h , 然后与抗细胞色素c 单克隆抗体振荡温育过夜。倾去一抗后, 再与二抗振荡温育2 h 。然后用碱性磷酸酶显色试剂盒显色[6 ] 。
2 结果(Results)
2. 1 TFAR19 蛋白质诱导线粒体PTP 缓慢开放线粒体肿胀是PTP 开放的直接结果, 因此测定线粒体肿胀可以直接反映PTP 是否开放[6 , 7 ] 。线粒体肿胀导致线粒体透射光增多, 散射光减少。我们发现, 10 mg/ L 的TFAR19 蛋白质加入到线粒体悬浮液中, 引起线粒体悬浮液的90°光散射缓慢下降, 说明10 mg/ L 的TFAR19 蛋白质能够缓慢引起线粒体PTP 的开放, 且呈现量效关系(图1) 。PTP 的抑制剂环胞菌素A (CsA) 和Bcl2xL 能抑制TFAR19 引起的线粒体肿胀(图2) 。
Fig. 1 TFAR19 induced mitochondrial swelling
Mitochondrial swelling was monitored spectrometrically at 1 g/ L by thedecrease of 90°light scatter at 520 nm. Trace b , c and d , TFAR19 protein(1 mg/ L , 5 mg/ L and 10 mg/ L) was added respectively as indicated ; trace a was control , mitochondria only without additions.
Fig. 2 The effects of Bcl2xL and CsA on mitochondrialswelling induced by TFAR19
Mitochondrial swelling was monitored spectrometrically at 1 g/ L by the decrease of 90°light scatter at 520 nm. Trace b and trace c , CsA(1μmol/ L) and Bcl2xL (16 mg/ L) respectively was first incubated withthe mitochondira , then TFAR19 ( 10 mg/ L ) was added as indicated ;trace d , TFAR19 protein (10 mg/ L) was added as indicated ; trace a was control , mitochondria only without additions..
2. 2 TFAR19 蛋白质使线粒体跨膜电位(ΔΨm) 下降PTP 开放会引起线粒体跨膜电位(ΔΨm) 的崩溃[14 ] 。罗丹明123 (Rh123) 是阳离子染料, 能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体基质, 而使其荧光猝灭。线粒体跨膜电位丧失后, Rh123 重新释放出线粒体, 从而发出荧光[13 ] , 以跨膜电位生成后加入解偶联剂CCCP 使荧光强度上升程度作为正常跨膜电位的量度, 表明TFAR19 可以诱导线粒体膜电位的下降; Bcl2xL 和CsA 也能够阻止TFAR19 引起的线粒体膜电位的下降(图3) 。
Fig. 3 Loss of the isolated mitochondrial membrane potentialinduced by TFAR19 , and the effects of Bcl2xL and CsAIsolated mitochondria ( 1 g/ L) were incubated at 25 ℃ in the mediumcontaining 250 mmol/ L sucrose , 2 mmol/ L HEPES (pH 7. 4) , 0. 5
mmol/ L KH2PO4 , 2μmol/ L rotenone and 4. 2 mmol/ L potassium succinate to energize mitochondria. ΔΨm was assessed by measuring the membrane potential dependent uptake of rhodamine 123 ( Rh123) with excitation at 500 nm and emission at 530 nm after addition of 30 nmol/L Rh123 to the mitochondria suspension. Trace a , TFAR19 (10 mg/ L)was added as indicated ; trace b and c , CsA(1μmol/ L) , Bcl2xL (16 mg/L)
respectively was first incubated with the mitochondira , then TFAR19(10 mg/ L) was
dded as indicated , trace d was control , mitochondria only without additions. CCCP (uncoupling agent , 3 μmol/ L) was used as internal control in all the experiment .
Fig. 4 The release of cytochrome c from isolated mitochondria induced by TFAR19
Isolated mitochondria (1 g/ L) were treated for 25 min at 25 ℃with recombinant TFAR19 (10 mg/ L) or in the presence of Bcl2xL or CsA in the medium containing 250 mmol/ L sucrose , 2 mmol/ L HEPES (pH7. 4) , 0. 5 mmol/ L KH2PO4 , 2 μmol/ L rotenone and 4. 2 mmol/ L potassium succinate. After incubation , mitochondria suspension was
centrifuge at 12 000 g for 5 min. The presence of cytochrome c in mitochondrial supernatants was assessed by immunoblot analysis. Lane 1 ,negative control ( supernatant of untreated mitochondria) ; lane 2 , positive control (pellet of untreated mitochondria) ; lane 3 and lane 4 , Bcl2xL(16 mg/ L) and CsA ( 1 μmol/ L) were preincubated with mitochondria before TFAR19 (10 mg/ L) was added ; lane 5 , TFAR19 (10 mg/ L) .
2. 3 TFAR19 引起线粒体释放细胞色素c
细胞色素c 是胱冬肽酶29 (caspase29) 激活的辅助因子。已经证明, 细胞色素c 从线粒体膜间隙释放是PTP 开放的直接结果[15 , 16 ] 。我们的结果证
明, 10 mg/ L TFAR19 能诱导细胞色素c 释放。环胞菌素A、Bcl2xL 能抑制TFAR19 引起的线粒体细胞色素c 释放(图4) 。
3 讨论(Discussion)
T FA R19 基因是北京大学人类疾病基因中心从人白血病细胞株TF21 细胞中克隆到的新的凋亡相关基因。基因全长559 bp , 编码125 个氨基酸,mRNA 斑点杂交显示TRA R19 在许多组织中有表达, 但是在胚胎的表达远少于成体。初步的研究发现, 该基因在细胞凋亡时高表达, 其表达产物具有抑制肿瘤细胞生长和促进凋亡作用[1～3 ] 。重组的人TFAR19 蛋白对撤除细胞因子的HL260 细胞具有明显的促凋亡效应[5 ] ; 对γ射线诱导MCF27 细胞凋亡有促进作用[4 ] ; 对羟基喜树碱诱导人7721 肝癌细胞凋亡有增敏作用[17 ] 。但是, 其如何发挥促进凋亡和抑制增殖效应的确切作用机制还不清楚。最近的研究表明, 线粒体在凋亡过程中起重要的调节作用。线粒体膜通透性改变可能是细胞死亡的关键性机制[18 ] 。线粒体通透性转运孔( PTP) 的开放能够导致线粒体跨膜电位(ΔΨm) 的崩溃、胱冬肽酶(caspases) 活化和凋亡诱导因子〔细胞色素c 、凋亡诱导因子(AIF) 、Smac/ DIABLO 等〕的释放、ATP 生成减少、以及有时由于氧的不完全氧化导致的氧自由基的产生增加[19～21 ] 。本研究显示, 在体外条件下, TFAR19 可以直接作用于鼠肝线粒体, 导致其功能受损, 包括线粒体通透性转运孔( PTP) 开放、跨膜电位(ΔΨm) 丧失、以及细胞色素c 释放。TFAR19 可以直接作用于线粒体, 使其PTP缓慢的开放, 导致线粒体肿胀, 90°光散射下降。这种作用可以被CsA 和Bcl2xL 抑制。PTP 的生理作用目前还不清楚, 它可能参与细胞内钙稳态的调控及生理性钙振荡, 同时可能防止线粒体钙超载; 它还可能参与ATP/ ADP 的转运和能量代谢[22 , 23 ] 。另外, 作为许多生理效应〔包括电压、二价阳离子、线粒体基质pH、氧化还原状态、ADP、ATP、一些代谢产物(葡萄糖、肌酸、泛醌) 等〕的感受器[16 ] ，PTP 整合了电生理、氧化还原状态与细胞代谢状态的信息。因此, PTP 在维持线粒体和细胞的正常的生理功能方面起非常重要的作用。线粒体膜通透性1 8 2 May , 2002 田辉凯等: TFAR19 促进小鼠肝线粒体膜通透性转运孔的开放改变, 主要是指内膜的通透性突然的升高。正常情况下, 线粒体外膜上的电压依赖性阴离子通道
(voltage2dependent anion channel , VDAC) 可以允许分子量5 kD 以下的分子通透, 使得呼吸链底物(如NADH、FADH 和ADP/ ATP 等) 能够在细胞质和线粒体间隙之间自由交换。相反, 线粒体内膜几乎是没有通透性的, 以维持跨内膜的电化学质子梯度,保证线粒体呼吸链的正常运转。PTP 的开放有两种状态: 一种是低电导性(low conductance) 通道, 直径约为1. 8 nm , 这是一种短暂和可逆的开放, 可能参与钙离子的释放或ADP 的转运; 另外一种为高电导性(high conductance) 通道, 直径约为2. 5～3. 0nm , 这是一种病理性的不可逆开放, 可以导致细胞凋亡或死亡[22～24 ] 。我们这里指的PTP 开放主要指后一种。PTP 开放可以使分子量高于1. 5 kD 的物质进入线粒体基质, 导致线粒体肿胀。随着线粒体的肿胀, 折叠的内膜逐渐打开, 最终导致线粒体外膜胀破, 使得线粒体间隙内促凋亡因子释放[14 , 25 ] 。TFAR19 诱导线粒体膜电位下降, 导致跨膜电位(ΔΨm) 崩溃。Bcl2xL 和CsA 均可以抑制TFAR19引起的线粒体膜电位下降我们知道, 电子经呼吸链传递的同时, 将质子从线粒体内膜的基质侧泵到内膜外, 线粒体内膜不允许质子回流, 因此造成膜内外的电化学梯度, 这里既有H+ 浓度的梯度, 又有跨膜电位差, 这种电化学梯度的形成可以看作能量的储存, 当质子顺梯度回流时则驱动ADP 与Pi合成ATP。而TFAR19 可能通过作用于PTP 使其开放, 使质子回流来介导线粒体膜电位的下降, 致使线粒体合成ATP 受阻。使细胞能量的供给发生危机, 促进细胞凋亡。
CsA 与基质中的亲环蛋白D (cyclophilin D) 结合, 高效特异地抑制线粒体PTP 的开放[26 , 27 ] 。亲环蛋白D 是基质中的肽基2脯氨酰基顺反异构酶,通过与PTP 组分中的腺苷酸转位蛋白(adenine neucleotide t ranslocator , ANT) 直接作用行使功能。当CsA 与亲环蛋白D 结合后, 亲环蛋白D 与PTP 中的ANT 的结合位点分离, 使PTP 开放受到抑制。Bcl2xL 属于Bcl22 家族, 主要锚定于线粒体外膜上,
它可以在内外膜接触处插入内膜与ANT 作用[28 , 29 ] 。这两种抑制剂, 均能抑制TFAR19 的作用, 提示TFAR19 可能直接作用于PTP , 使其开放, 但是也不能完全排除通过其他机制间接作用于PTP 的可能性。这方面还有待于进一步的研究。最新的研究结果显示[30 ] , 在不同的因素诱导细胞凋凋亡过程中, TFAR19 均高表达于细胞质,然后出现核转位现象。核转位现象早于磷脂酰丝氨
酸(phosphatidylserine , PS) 外翻, 平行于线粒体的膜电位下降。属于凋亡的早期事件。提示, TFAR19的胞质中的高表达早于线粒体的膜电位下降, 应该处于线粒体功能受损伤的上游, 然后才出现TFAR19 核转位现象。结合本试验的结果, 推测TFAR19 在高表达于胞质的过程中作用于线粒体,使线粒体的功能受损。但是, 关于凋亡过程中的T FA R19 的核转位现象以及与凋亡的关系的意义还不清楚, 需要进一步的研究。
基于上述实验结果和相关文献报道可以初步得出这样一个结论, TFAR19 对细胞凋亡的促进作用是一种正反馈放大效应, 细胞接受各种凋亡信号,开始决定走向凋亡, 初期激活T FA R19 基因, 使其高表达, 表达产物再反过来作用于线粒体, 使其PTP 开放, 跨膜电位崩溃, 肿胀, 释放细胞色素c等凋亡因子, 从而放大凋亡信号, 形成正反馈放大环路, 促进细胞凋亡的发生发展。这应是TFAR19
对细胞凋亡的促进作用的生理意义所在。
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