【求助】请帮忙看看我的细胞组化片子

1.做了两次，阴性都有显色，而以前做过全蛋白的Western，阴性是基本没有什么条带的。请问大家一般用5%BSA封闭多长时间啊，我37度1.5小时。二抗的浓度我用的1：130，37度40分钟，会不会太烈了？还有，PBS洗的时候是流水冲洗 还是浸泡呢，我是浸泡的，每片10ml,少不少？
2.从这个比较来看算有阳性结果么，我没有做复染。我的蛋白据报道是胞浆的。不明白的是好像在阳性的片子中细胞核的轮廓特别清晰，而阴性的片子中就不大看得出来，这是什么原因呢？会不会是因为胞浆的显色把细胞核的轮廓衬出来了呢?但是为什么显色的部位都在细胞核的附近，远距离的胞浆好像着色不明显呢？
请高手帮帮忙啊