【讨论】关于园内质粒线性化的小结

质粒线性化

一、为什么要进行质粒线性化？
线性化质粒是为了使质粒容易整合入宿主基因组。所以如果你转染的目的是瞬时转染，则不用线形化，如果是为了获得稳定表达细胞株，特别是悬浮细胞，则最线性化。原因：质粒转染入细胞后，如果不线性化，则质粒在整合入染色体时，其断裂点是随机的，在这种情况下，有些断裂位点可能位于你的目的基因中，当这样的整合发生后，由于筛选基因是正常的，所以用筛选药物筛选时，细胞不能被杀死，但由于目的基因已断裂，因而不表达蛋白。这种情况很常见。常听到同行说他们实验室的细胞用筛选物不能杀死，但却检测不到蛋白的表达，这可能是原因之一。用于贴壁细胞时，质粒虽然可不经线性化，但筛选后得到的克隆中，只有少数表达蛋白；而在悬浮细胞，则必须用有限稀释法克隆，得到表达蛋白的克隆后再扩增。（
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=70049&sty=3&keywords=%D6%CA%C1%A3%CF%DF%D0%D4%BB%AF ）

二、重组质粒线性化后如何纯化?
方法一（试剂盒法）：有很多胶回收试剂盒可以不经跑胶直接用于纯化DNA，你可以看看你们胶回收试剂盒的说明，还有注意一下柱子回收大片段的得率如何，我用的胶回收试剂盒是上海华舜的，回收片段最大是10kb。如果不用柱子可否考虑用土办法？也就是酶切体系用苯酚－氯仿和氯仿各抽提一次，然后加1/10体积的醋酸钠，2倍体积无水乙醇沉淀，最后用70％乙醇洗涤，适当的灭菌去离子水或PH8.0TE溶解。我处理载体时就是这样做的，接下来的去磷酸化及连接转化都没有问题。
个人经验，仅供参考。（ http://www.dxy.cn/bbs/thread/9686086 ）
方法二（割胶回收法）：用割胶回收试剂盒？由于我酶切的比较多（好似酵母转化需要很多的线性化质粒），现在构建了200ul体系。如果割胶的话，我至少点4个孔。
没有必要点四个孔，用透明胶把两个梳子齿粘起来，就可以了。用Qiagen的胶回收盒子就可以了，他们说明书是10kb，我是做腺病毒的，用这个回收40Kb的重组载体都没有问题，只是最后一步离心的时候稍加改变，1/3最终体积洗脱3次，每次离心为14000r'pm/min。（ http://www.dxy.cn/bbs/thread/9686566 ）
方法三：请问我直接60度20分钟灭活，然后酒精沉淀，80洗涤，晾干，加水溶解可以吗？
我觉得可以，我回收连接产物就是那样做的，70度水浴灭活酶10分钟，然后加醋酸钠和无水乙醇沉淀，70％乙醇洗涤，晾干，无菌去离子水溶解，电转化都没问题。你可以试一下，做转化看效果怎么样。（ http://www.dxy.cn/bbs/thread/9700257 ）

三、质粒线性化时酶切位点的选择
我想稳定转染前把质粒酶切成线性，质粒是PcDNA3.0，可以选择的酶有Pvu1,Nru1 请教高手那个位点比较合适呢？
两个酶都没有破坏CMV 启动子和SV40启动子，不影响目的基因和G418抗性基因的表达 ！应该都可以使用！（ http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/6467811_0.html ）
对于线性化时酶切位点的选择，哪位战友还有高见，请不吝赐教。