【求助】3T3-L1低分化率

这学期一直在做前脂肪细胞3T3-L1的分化，但试了n次，除了偶尔几次分化率还好（70～80％）以外，其余总是只是在局部分化或者整体分化的都很少，呈现斑点状在整个皿里分布（两张图是从同一个皿中拍摄而得），一直很苦恼。希望熟悉的前辈能给予一些指导。

具体操作是这样的：
1. 待10cm dish中细胞达70～80％ confluent，传代并1:1分盘与35mm dish中。
2. 待细胞达接触抑制时，正常培养medium换液。
3. 两天后，加入含0.5mM Mix，1uM Dex，1.0ug/ml Insulin的10％FBS medium进行诱导分化（day 0）
4. 两天后换为只含insulin的10％FBS medium进行诱导（day 2）
5. day 4时换为不含诱导剂的10％FBS medium，以后每两天换一次液。
6. day 7或day 8油红染色。

mix为06年12月到货的，干粉存在于-20度中，今年3月的时候配制了10ml，分装至1.5ml EP管中，-20度保存。平时进行诱导分化的时候，从-20中取出融化。分装的insulin存于 -20中，使用后的insulin为避免反复冻融就直接放于4度中。诱导剂是事先加入到FBS medium中混匀后再加入到皿中的。
除了3月以及6月两次分化结果还比较理想外，其余n次分化均比较糟糕。
希望师姐能帮我分析一下实验的问题所在。
此外还有如下问题：
1.  Mix粉剂购买后一般能存放多久而保持不被氧化、对于分化没有明显的影响？分装贮存于-20度中的Mix也最好在两个星期内使用吗？即使是从未拿出来使用过的？
2.  细胞传代的时候以1:1分盘，密度大概为1×10 5/ml,而接触抑制的时候细胞密度约为2×10 5/ml。
3.  经常在诱导分化day 4换为FBS medium，一天后观察到有较多的圆亮细胞漂起，自己认为滴加时已经比较小心了，可是还是会存在。而若继续用含insulin的FBS medium处理（day 4），则未观察到圆亮漂起的细胞，而且当然分化也好很多。想问一下这些漂起的细胞是脂肪细胞吗？这种现象是否正常？该怎么去改变？
4.  皿中斑点状分化的出现的原因是什么？是否分化不好的时候就容易出现这种现象？day 4加入insulin继续处理，虽然分化率整体明显增高，但还是有同样的现象，从图上观察好像很红的斑点处细胞也密一些。

开始的时候怀疑是自己操作的原因，所以重复了几次但还是没怎么改善。比较过insulin, 刚从-20中拿出来的和4度中的没有明显差别；细胞1:1分盘，达到接触抑制时的密度大概增长了一倍，一般需2天，有时为1天。