实验专栏丨一文掌握CCK-8细胞增殖与毒性检测法

一、CCK-8实验原理：

全称为Cell Counting Kit-8，在电子载体1-Methoxy PMS存在的情况下能够被细胞内脱氢酶还原成水溶性的甲臜染料，生成的（橙黄色）甲臜量与活细胞数量成正比，即颜色的深浅与细胞的增殖成正比。因此可以用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。 

CCK-8实验原理

二、优点：

1、使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；

2、CCK-8法能快速检测；

3、CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；

4、CCK-8法的重复性优于MTT 法，MTT 实验生成的formazan 不是水溶性的，需要使用DMSO 等有机溶剂溶解；

5、而本方法产生的formazan 是水溶性的，不仅省去了溶解步骤，更因此而减少了该操作步骤带来的误差；

6、CCK-8法对细胞毒性小，可以多次测定选取最佳测定时间，与MTT 方法相比线性范围更宽，灵敏度更高；

7、CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。

三、缺点：

与MTT相比，CCK-8和MTS的价格贵。

 表1 CCK法与其他细胞增殖/毒性检测方法的优势比较

四、实验材料及试剂

96孔板、CO2培养箱、酒精灯、移液枪、酶标仪等；细胞、CCK8等。

CCK8重复加样（中洪博元实拍图，勿盗）

五、实验内容

实验一：细胞活性检测

1、在96孔板中接种细胞悬液（100μL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养（37℃,5% CO2）。

2、向每孔加入10 μL CCK溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。

3、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

4、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

5、若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。

实验二：细胞增殖-毒性检测

1、在96孔板中配置100μL的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时（37℃，5% CO2）。

2、向培养板加入10μL不同浓度的待测物质。

3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24或48小时）。

4、向每孔加入10μL CCK溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。

5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

7、若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。

注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

三、注意事项

1、CCK8可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。

2、在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染，以免影响结果。

3、CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年。

4、当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。

5、一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。

6、在培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度即为空白对照。

7、在做加药实验时，还应考虑药物的吸收，可在加入药物的培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。

8、金属对CCK-8显色有影响：当终浓度为1mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10 mM的话，将会100%抑制。

9、悬浮细胞由于染色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。