【讨论】Trouble Shooting－质粒提取篇【20070420更新】
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在实验中经常遇到一些问题，
我们大家可以讨论一下，如果我们能够完善一个Trouble Shooting的解决方案，出现问题时找一找，我们就可以更加具有针对性的解决它，那就不必再象以前一样，发个求助帖，然后很着急地不停刷新，急于看到应助的信息。使我们更加主动，同时也减少重复询问带来的麻烦。
下面是我的一点经验，有对的，当然也会有错误，更有不足。还希望大家指正完善，作为“Trouble Shooting”的第一篇，我会及时将大家的意见和建议采纳进来，修正错误、完善内容，让我们一起努力！
Trouble Shooting－质粒提取篇
1. 细菌离心后，加入溶液I蜗旋振荡时，发现菌体呈絮状不易混匀，或成细砂样。—— 很可能是细菌发生溶菌，可减少培养时间、降低培养温度试试看，通常降低培养温度会使细菌生长更加稳定；同时也可以试试平板培养，培养后，用PBS将菌落洗下，再进行质粒的提取，固体培养基上细菌生长的要好一些。
2. 加入溶液II，菌液浑浊度没有发生明显变化。—— 裂解不完全，主要问题是发生在溶液II上。确保10％SDS是澄清的，确认NaOH是有效的，如使用的是试剂盒，确认溶液II是澄清没有沉淀的。如确认原因不是发生在溶液II上，而是细菌浓度比较高，可相应增加溶液I/II/III的体积。此外，啤酒肚16059978战友还提出，有可能是“杂菌”污染，具体见 http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=154&id=8822327&sty=3 。
3. 加入酚仿抽提，离心后在水相和有机相间没有变性蛋白层，但随后的乙醇沉淀发现大量的半透明沉淀，溶解后蛋白浓度高。—— 乙醇沉淀时，较纯的质粒沉淀应该是白色（PEG纯化的沉淀是透明的，肉眼不易发现），如沉淀是半透明的凝胶状，则是蛋白含量高。出现此类问题时确认两点：1. 平衡酚是否被氧化、pH是否是8.0？2. 溶液I/II/III反应后，离心的上清pH是否在8.0左右。有时，由于溶液III配置的问题，导致溶液I/II/III反应后离心的上清pH与8.0偏差较大，导致平衡酚抽提时没有有效的将蛋白抽提出来，有时，离谱的pH会导致水相和平衡酚互溶。
4.使用酚仿抽提方法，质粒A260/A280的纯度也很好，但酶切不能完全切开——1.确认酶的有效性；2. 平衡酚是否被氧化而呈现棕色，而非正常的黄色；3. 是否不小心吸入了痕量的酚；4.乙醇沉淀后，70%乙醇漂洗的是否充分，残留的盐类会影响酶切；5.乙醇漂洗后是否完全干燥，残留的乙醇会影响酶切；
5. 提取质粒中RNA没有去除 ——主要原因是RNase失效，或效率不高。建议：1.更换RNase A，并保证其储存条件是正确的；2.对于手工提取质粒，可单独增加一步去处RNA的步骤 ，即溶液III反应后，离心的上清中加RNase，室温37度去RNA10min~30min，但需要保证你的RNase A是经过失活DNase的，同时较高温度（如50度）会更加快速完全的去除RNA，但本人经验，经过高温处理的质粒质量也不高。
6. 传统手工大提质粒，使用PEG8000纯化的问题 —— A. PEG8000不需要灭菌，当然，你要确认你的PEG8000是分子生物学使用级别（我们一直使用的SIGMA的）；B. 有战友说PEG8000纯化后的得率很低，可能需要确认一下问题：加入PEG8000前，质粒溶液是否是TE，而不是含有大量其它杂盐得溶液。在PEG8000纯化前，质粒溶液应该是经过乙醇或异丙醇沉淀，且经过70％乙醇漂洗过的；沉淀步骤应在冰上或4度进行。C.关于PEG8000处理后离心看不见沉淀的问题：PEG8000的沉淀是透明的，有时可以看到沉淀，而有时很难辨出沉淀，但后续酚仿抽提时会在水相和有机相间出现大量白色沉淀层。
7. 试剂盒提取质粒，质粒浓度不理想的问题——检查漂洗液，是否配置太久，而且在使用后没有旋紧盖子。
8. 培养基、抗生素、质粒提取都没有问题，而细菌菌液提取不到质粒——我也不清楚，以前需要高手来解答；wanghongquan曾提出过该问题，见
http://www.dxy.cn/bbs/thread/8568874
我进来也遭遇到了。质粒保存的甘油菌，和同批其它的细菌一起培养，提完质粒后，发现其中1个没有质粒，double-check仍然依旧。
smartkevin战友提供了一个很好的思路：如果是氨苄抗性的话，有可能是质粒丢失造成的。主要是培养时间较长，导致培养基中的beta-内酰胺酶过多，作用时间过长，同时培养基pH值降低，氨苄青霉素失活，从而使无质粒的菌株大量增殖。解决的办法：可以添加葡萄糖，缩短培养时间，改用羧苄青霉素。
9. 原先测序鉴定没有问题的细菌，37度摇菌后发现质粒大小或序列出现异常—— 这种情况出现的几率较小，回想以前曾经遭遇过两次。常出现在较大质粒或比较特殊的序列中，质粒一次是编码病毒RNA聚合酶的表达/转录质粒，一次是AdEasy系统中的大质粒pAdeasy-1，37度培养后发现质粒变小。前一个质粒进行测序证实其中有500bp的序列丢失。后一个质粒酶切发现缺失了约6kb。解决办法：a.降低培养温度，在20~25度下培养，或室温培养可明显减少发生概率；b. 使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。
未完，待补充。
我们大家可以讨论一下，如果我们能够完善一个Trouble Shooting的解决方案，出现问题时找一找，我们就可以更加具有针对性的解决它，那就不必再象以前一样，发个求助帖，然后很着急地不停刷新，急于看到应助的信息。使我们更加主动，同时也减少重复询问带来的麻烦。
下面是我的一点经验，有对的，当然也会有错误，更有不足。还希望大家指正完善，作为“Trouble Shooting”的第一篇，我会及时将大家的意见和建议采纳进来，修正错误、完善内容，让我们一起努力！
Trouble Shooting－质粒提取篇
1. 细菌离心后，加入溶液I蜗旋振荡时，发现菌体呈絮状不易混匀，或成细砂样。—— 很可能是细菌发生溶菌，可减少培养时间、降低培养温度试试看，通常降低培养温度会使细菌生长更加稳定；同时也可以试试平板培养，培养后，用PBS将菌落洗下，再进行质粒的提取，固体培养基上细菌生长的要好一些。
2. 加入溶液II，菌液浑浊度没有发生明显变化。—— 裂解不完全，主要问题是发生在溶液II上。确保10％SDS是澄清的，确认NaOH是有效的，如使用的是试剂盒，确认溶液II是澄清没有沉淀的。如确认原因不是发生在溶液II上，而是细菌浓度比较高，可相应增加溶液I/II/III的体积。此外，啤酒肚16059978战友还提出，有可能是“杂菌”污染，具体见 http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=154&id=8822327&sty=3 。
3. 加入酚仿抽提，离心后在水相和有机相间没有变性蛋白层，但随后的乙醇沉淀发现大量的半透明沉淀，溶解后蛋白浓度高。—— 乙醇沉淀时，较纯的质粒沉淀应该是白色（PEG纯化的沉淀是透明的，肉眼不易发现），如沉淀是半透明的凝胶状，则是蛋白含量高。出现此类问题时确认两点：1. 平衡酚是否被氧化、pH是否是8.0？2. 溶液I/II/III反应后，离心的上清pH是否在8.0左右。有时，由于溶液III配置的问题，导致溶液I/II/III反应后离心的上清pH与8.0偏差较大，导致平衡酚抽提时没有有效的将蛋白抽提出来，有时，离谱的pH会导致水相和平衡酚互溶。
4.使用酚仿抽提方法，质粒A260/A280的纯度也很好，但酶切不能完全切开——1.确认酶的有效性；2. 平衡酚是否被氧化而呈现棕色，而非正常的黄色；3. 是否不小心吸入了痕量的酚；4.乙醇沉淀后，70%乙醇漂洗的是否充分，残留的盐类会影响酶切；5.乙醇漂洗后是否完全干燥，残留的乙醇会影响酶切；
5. 提取质粒中RNA没有去除 ——主要原因是RNase失效，或效率不高。建议：1.更换RNase A，并保证其储存条件是正确的；2.对于手工提取质粒，可单独增加一步去处RNA的步骤 ，即溶液III反应后，离心的上清中加RNase，室温37度去RNA10min~30min，但需要保证你的RNase A是经过失活DNase的，同时较高温度（如50度）会更加快速完全的去除RNA，但本人经验，经过高温处理的质粒质量也不高。
6. 传统手工大提质粒，使用PEG8000纯化的问题 —— A. PEG8000不需要灭菌，当然，你要确认你的PEG8000是分子生物学使用级别（我们一直使用的SIGMA的）；B. 有战友说PEG8000纯化后的得率很低，可能需要确认一下问题：加入PEG8000前，质粒溶液是否是TE，而不是含有大量其它杂盐得溶液。在PEG8000纯化前，质粒溶液应该是经过乙醇或异丙醇沉淀，且经过70％乙醇漂洗过的；沉淀步骤应在冰上或4度进行。C.关于PEG8000处理后离心看不见沉淀的问题：PEG8000的沉淀是透明的，有时可以看到沉淀，而有时很难辨出沉淀，但后续酚仿抽提时会在水相和有机相间出现大量白色沉淀层。
7. 试剂盒提取质粒，质粒浓度不理想的问题——检查漂洗液，是否配置太久，而且在使用后没有旋紧盖子。
8. 培养基、抗生素、质粒提取都没有问题，而细菌菌液提取不到质粒——我也不清楚，以前需要高手来解答；wanghongquan曾提出过该问题，见
http://www.dxy.cn/bbs/thread/8568874
我进来也遭遇到了。质粒保存的甘油菌，和同批其它的细菌一起培养，提完质粒后，发现其中1个没有质粒，double-check仍然依旧。
smartkevin战友提供了一个很好的思路：如果是氨苄抗性的话，有可能是质粒丢失造成的。主要是培养时间较长，导致培养基中的beta-内酰胺酶过多，作用时间过长，同时培养基pH值降低，氨苄青霉素失活，从而使无质粒的菌株大量增殖。解决的办法：可以添加葡萄糖，缩短培养时间，改用羧苄青霉素。
9. 原先测序鉴定没有问题的细菌，37度摇菌后发现质粒大小或序列出现异常—— 这种情况出现的几率较小，回想以前曾经遭遇过两次。常出现在较大质粒或比较特殊的序列中，质粒一次是编码病毒RNA聚合酶的表达/转录质粒，一次是AdEasy系统中的大质粒pAdeasy-1，37度培养后发现质粒变小。前一个质粒进行测序证实其中有500bp的序列丢失。后一个质粒酶切发现缺失了约6kb。解决办法：a.降低培养温度，在20~25度下培养，或室温培养可明显减少发生概率；b. 使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。
未完，待补充。
