肿瘤增殖抗原(Ki67)和抑癌基因(P16)review
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肿瘤增殖抗原(Ki67)和抑癌基因(P16)
在人类肿瘤组织表达的研究进展
Ki67抗原(Ki67 antigen)，简称为Ki67,是应用最广泛的增殖细胞标记之一。Ki67标记指数(labeling index，LI)是评估人类各种组织增殖组分的可靠而简便的方法，是目前已知的增殖抗原中最具增殖能力代表性的指标。现在Ki67的研究多用于评价细胞增殖活性、细胞周期与肿瘤的生长方式、浸润方式、复发、转移等生物学行为，即用于判断肿瘤的良、恶性及恶性程度。抑癌基因(tumor suppressor gene)P16是人类发现的第一个直接参与细胞周期调节的抑制基因，也是目前已知抑癌基因中唯一通过直接抑制细胞周期而抑制细胞生长的基因，当P16基因由于缺失或突变不能表达时，导致细胞呈失控性生长而形成肿瘤。近年来,关于Ki67和P16的异常表达与肿瘤发生发展关系的研究已成为肿瘤分子生物学研究的热点之一。下面就Ki67和ｐ16基因与人类肿瘤的关系研究进展综述如下。
1 Ki67
1.1 Ki67抗原和抗体的特征:
1.1.1 Ki67抗原
Ki67属于非组蛋白，对蛋白酶高度敏感，Ki67蛋白的结构包含200个以上的磷酸化部位，19个N豆蔻酰化部位，3个酰肽化部位及40个弱和10个强PETS区(富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸的区域)。PETS序列是蛋白易于降解的部位，这也是Ki67半衰期较短的原因。Ki67蛋白由相对分子质量为358761和319508的两条多肽链组成，由2个相连接的9768和8686bp的ｍRNA所编码。该cDNA含有14个内含子和15个外显子。第13外显子是其中心部位，长6845个bp，含有16个366bp的重复序列和1个62bp的保守序列，后者称为Ki67基元(motif)，编码Ki67的决定簇。Ki67存在两种cDNA型：长型和短型，因而Ki67蛋白在Western blot中呈现345000和395000两条区带。编码Ki67的人类基因定位于第10号染色体的长臂上(10q25)[1]。Ki67抗原的量随细胞周期的不同而发生改变。在G1中期到后期出现表达，S期和G2期逐渐增加，有丝分裂期达到高峰，分裂后迅速降解或丢失抗原决定簇，半衰期为1h或更短，且很难分离提取，限制了它在外周血标本的研究。Ki67的位置分布与细胞周期有关。对人胚胎肺细胞株的各种状态时Ki67分布情况的研究，有学者观察到细胞间期和分裂期Ki67的染色方式不同。G1后期位于细胞核周围区，S期均匀分布于核浆中，G2期除核周围仍存在外，核浆中出现混合型细小和斑点状颗粒。在分裂前期，Ki67位于核浆，分裂期位于胞质，且两个时期的染色体附近均有浓密分布，分裂后期和末期迅速消失。Ki67的功能与细胞的有丝分裂有关，它可能是染色质内部及周围的非组蛋白基质，可看作为染色体骨架，可能是具有结合特性的重要结构蛋白，在有丝分裂中起着维持DNA规则结构的重要作用[2]。
1.1.2 Ki67抗体
Ki67抗体(Ki67 antibody)是在1983年由Gerdes等用霍奇金瘤系Ｌ428细胞的粗核成分免疫鼠后首次制备出的鼠单克隆抗体，属于IgG1家族。当时的实验地点是在德国的Kiel城市，所用组织培养板的编号为67，由此而得名，对应的抗原命名为Ki67抗原。
1.2 Ki67的检测方法
以往大多应用Ki67抗体来检测Ki67。Ki67的半衰期仅1h左右，以前此种方法多局限在新鲜组织和冰冻切片的研究中。1991年Shi等[3]用组织切片在微波炉加热的技术恢复抗原决定簇，使福尔马林固定石蜡包埋的档案标本可行免疫组化染色。这种抗原恢复技术同样可恢复Ki67的免疫活性[4]，从而使Ki67广泛地应用于人类肿瘤细胞增殖活性的研究。
1.3 Ki67对肿瘤细胞增生程度的评价：
肿瘤细胞增生是否活跃直接影响着临床治疗方案的选择与预后。传统上判断肿瘤是否生长活跃是靠病理组织学观察细胞分裂象的多少来决定的，一般采用常规的形态指标(如肿瘤的浸润、转移、体积、核分裂象数、细胞异型性和肿瘤性坏死等)来划分肿瘤的性质。间质瘤的浸润和转移被认为是诊断恶性的确定指标。但由于计数不准确及影响因素太多而临床应用价值有限。通过Ki67的单克隆抗体以免疫组化对瘤细胞增殖抗原进行定位定量分析是最为简便、可靠的方法。这些肿瘤细胞增殖抗原已证明与许多肿瘤的预后有关，即Ki67阳性细胞多者，其恶性度增高，预后不良。众多研究已表明Ki67标记指数能可靠地反映正常和病变增殖活性，对许多良、恶性肿瘤的鉴别，可作为有参考价值的辅助指标,也有利于良性病变癌变可能性的预测，恶性肿瘤的早期诊断、治疗方法选择和疗效的评估。
2 P16基因
2.1 P16基因的发现及命名
P16是人类发现的第一个直接参与细胞周期调节的抑制基因，也是目前已知的抑癌基因中唯一通过直接抑制细胞周期而抑制细胞生长的基因。1992年，Beach等注意到：在黑色素瘤患者在第9号染色体存在1个黑色素瘤易感基因(tumor susceptibility gene )[5]；此后又发现，许多人类肿瘤细胞系中均有9号染色体短臂21～22(9p21-22)区域的异常，如纯合、杂合缺失或突变，故推测该区域内有肿瘤抑制基因存在。1993年，Serrano等[6] 克隆出此基因的cDNA，因其编码相对分子质量为16kd的蛋白质，故被命名为P16基因。P16基因的缺失与突变与多种肿瘤的发生有关,故命名为多肿瘤抑制因子(multiple tumor suppressor, MTS)。P16蛋白可与细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)结合，并抑制cyclinD/CDK4的活性,所以也叫作CDK4抑制因子(CDK4 inhibitor, CDK4I或P16ink4)[6]。
2.2 P16基因的结构
P16基因位于人类第9号染色体短臂2区1带(9p21)，全长8.5kb，由编码序列和两个内含子组成，编码序列从5'～3'被2个内含子分成三部分：5'区的126个碱基的外显子1,307个碱基的外显子2和3'区的11个碱基的外显子3[6]。1997年，黄长晖等[7]从Hela细胞中抽提总RNA，克隆了P16ink4基因的cDNA编码序列，其核苷酸序列及推测的氨基酸顺序如图1所示.
1 ATG GAG CCG GCG GCG GGG AGC AGC ATG GAG CCT TCG GCT GAC TGG CTG GCC ACG MET Glu Pro Ala Als Gly Ser Ser Met Glu Pro Ser Ala Asp Trp Leu Ala Thr
55 GCC GCG GCC CGG GGT CGG GTA GAG GAG GTG CGG GCG CTG CTG GAG GCG GGG GCG
Ala Ala Ala Arg Gly Arg Val Glu Glu Val Arg Ala Leu Leu Glu Ala Gly Ala
109 CTG CCC AAC GCA CCG AAT AGT TAC GGT CGG AGG CCG ATC CAG GTC ATG ATG ATG
Leu Pro Asn Ala Pro Asn Ser Tyr Gly Arg Arg Pro Ile Gln Val Met Met Met
162 GGC AGC GCC CGA GTG GCG GAG CTG CTG CTG CTC CAC GGC GCG GAG CCC AAC TGC Gly Ser Ala Arg Val Ala Glu Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Glu Pro Asn Cys
216 GCC GAC CCC GCC ACT CTC ACC CGA CCC GTG CAC GAC GCT GCC CGG GAG GGC TTC
Ala Asp Pro Ala Thr Leu Thr Arg Pro Val His Asp Ala Ala Arg Glu Gly Phe
270 CTG GAC ACG CTG GTG GTC CTG CAC CGG GCC GGG GCG CGG CTG GAC GTG CGC GAT Leu Asp Thr Leu Val Val Leu His Arg Ala Gly Ala Arg Leu Asp Val Arg Asp
324 GCC TGG GGC CGT CTG CCC GTG GAC CTG GCT GAG GAG CTG GGC CAT CGC GAT GTC
Ala Trp Gly Arg Leu Pro Val Asp Leu Ala Glu Glu Leu Gly His Arg Asp Val
378 GCA CGG TAC CTG CGC GCG GCT GCG GGG GGC ACC AGA GGC AGT AAC CAT GCC CGC
Ala Arg Tyr Leu Arg Ala Ala Ala Gly Gly Thr Arg Gly Ser Asn His Ala Arg
432 ATA GAT GCC GCG GAA GGT CCC TCA GAC ATC CCC GAT TGA AAG AAC CAG AGA GGC
Ile Asp Ala Ala Glu Gly Pro Ser Asp Ile Pro Asp —
486 TCT GAG AAA CCT CGG GAA ACT TAG ATC ATC AGT CAC CGA AGG TCC TAC AGG GCC (539)
图1 Hela细胞p16ink4cDNA序列及推断的氨基酸顺序
Fig.1 The sequence of p16ink4cDNA and the deduced order of amino acid in Hela cell
2.3 P16蛋白的生物学功能
P16蛋白是抑癌基因P16的表达产物。人类75%的癌细胞株有P16基因的缺失或突变，高于P53基因50%的突变率[8]，已经证实P16基因在黑色素瘤、肺癌、食管癌和白血病等中均存在频发的缺失和蛋白表达异常[9]。体外实验亦表明：用含有P16cDNA的载体转染癌细胞，可有效地抑制癌细胞克隆的形成。2000年，白雪源等[10]构建了复制缺陷型重组P16腺病毒，用纯化后的腺病毒感染人白血病细胞株HL-60后，在感染细胞中有外源性P16cDNA存在和P16蛋白表达，被感染的HL-60细胞的生长受到明显抑制，而对照腺病毒感染的细胞生长没有受到抑制，提示了P16与肿瘤抑制相关。也有研究报道在P16蛋白缺乏时肿瘤细胞的持续增殖能力可明显提高[11]，进一步证明了P16蛋白是一种抑癌蛋白。
2.4 P16调节细胞周期的作用机制
细胞周期调节依赖于一系列大分子蛋白质有序的活化与失活，以维持细胞的增殖和分化，保证机体的正常生长发育。细胞周期蛋白(cyclin，共有八种，以A~H来命名))和细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)促进细胞周期进展；而细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitor, CKI)则抑制细胞周期进程。CDK依赖其相应的cyclin配体使其激活，促进细胞增殖；而CKI通过抑制CDK的活性，抑制细胞增殖。P16蛋白作为一种CKI，能抑制细胞从G1期进入S期，对细胞的增殖起负调控作用。目前认为细胞周期的分子调控机制，涉及cyclin、CDK和CKI之间的相互作用，其中CDK的活性表达及调控尤为重要。真核细胞分裂必须通过G1期→S期的转换开始进行DNA合成，通过G2期→M期转换进入有丝分裂期，在这些转换过程中，CDK起着重要作用。CDK通过调节底物Rb(retinoblastoma)蛋白(是一种核磷蛋白, 分子量为110Ｋｄ)的磷酸化而促使G1→S和G2→M期的转换，导致细胞增殖。P16蛋白与cyclinD竞争结合CDK4，能够特异性抑制CDK4的活性从而阻止细胞从G1期进入S期，抑制细胞增殖；相反cyclinD与CDK4结合时，刺激细胞生长、分裂。当P16基因由于缺失或突变不能表达时，cyclinD与CDK4的结合占优势，过度刺激细胞分裂，细胞呈失控性生长，使在G1期未充分发育的细胞提前进入S期而形成肿瘤[12]。
3 Ki67和P16与人类肿瘤
3.1 Ki67与人类肿瘤
Ki67是反映细胞增殖的核抗原,在细胞周期的G1后期、S期、G2期和M期细胞核表达，其免疫组化染色能检测肿瘤的增殖特征，与肿瘤恶性程度、浸润性、转移、复发密切相关，能准确反映出肿瘤的性质〔13〕。
I Kenaga等[14]研究了绒毛状大肠腺瘤(VT)和管状大肠腺瘤(TT)、大肠癌的增殖及凋亡情况，认为随管状腺瘤不典型增生程度的加重，越接近于癌组织，其Ki67标记指数越高。Krecicki等运用免疫组化技术研究154例喉鳞癌中Ki67抗原表达情况，57%阳性表达，Ki67的表达在正常组与癌症组之间有明显不同，有助于区别喉表皮增生的良恶性[15]。郭贵龙等[16]研究认为：Ki67在正常组织中几乎不表达, 甲状腺滤泡状腺癌的Ki67表达最高, 甲状腺滤泡状腺瘤的表达次之；随着甲状腺恶性程度的增加，Ki67的表达依次增高。甲状腺滤泡状腺瘤与滤泡状腺癌相比较，两者的Ki67标记指数差异有极显著性意义，认为Ki67可作为评价甲状腺滤泡状肿瘤增殖度的指标。杨亦萍等[17] 的报告也认为：Ki67抗原的表达有助于良恶性甲状腺滤泡肿瘤的鉴别。
3.2 P16基因异常与肿瘤的关系
人类肿瘤中P16基因的变异形式多样，主要形式有以下几种:
第一、基因缺失或突变：包括纯合缺失、杂合缺失、基因内碱基缺失、点突变。在绝大部分肿瘤中P16基因缺失或突变具有下列特点[18]:
(1)缺失发生频率高于基因突变，缺失及突变的部位主要集中在外显子2上，有纯合缺失和杂合缺失、移码突变和点突变等多种形式。Kamb等[19]研究了来源于肺、脑、骨、皮肤、膀胱、肾、卵巢等的近300个肿瘤细胞株，纯合及杂合缺失占50%，碱基突变或缺失占25%，并且他认为纯合性缺失是P16基因失活的优势方式，而点突变可能不是失活的主要方式。2001年李淑锋等[20]采用双重PCR、PCR-SSCP和序列分析方法，对31例非小细胞肺癌、15例食管癌、13例胃癌、9例乳腺癌共68例原发肿瘤组织标本的P16基因进行了研究，结果显示P16基因在肺癌、食管癌、胃癌、乳腺癌中的缺失率分别为16%、20%、8%、0；仅有2例突变，1例食管癌在第130位氨基酸密码由AGA变为ATA，编码的氨基酸由精氨酸变为异亮氨酸，1例肺癌第140位氨基酸的CGC处的C缺失，导致移码突变。
(2)基因缺失、突变在肿瘤细胞株中高于相应的原发实体瘤。有学者认为, P16基因缺失、突变可能是细胞培养过程引起的，Kamb[19]等则认，原发实体瘤中缺失及突变率低是由于实体瘤中含有的正常细胞干扰了P16基因的检测。
第二、甲基化(methylation)：P16基因突变和缺失具有肿瘤类型的倾向性，但在某些肿瘤中其突变和缺失较少见，是由于P16基因上游CpG岛的甲基化和含有P16基因片段的染色质浓缩所致。P16基因过度甲基化时，抑制基因mRNA转录，导致该基因失活。据James等[21]报道，5'-CpG的甲基化是P16阻抑的重要方式，这一现象频繁地发生于胸部肿瘤(33%)、前列腺癌(60%)、结肠癌(90%)、肾癌(23%)，以及非小细胞肺癌、神经胶质瘤和头颈部肿瘤中[22]。5'-CpG片段是P16的启动子区域，与转录有关[23]，其甲基化使P16基因的转录受到抑制，在人类肾细胞癌中异常的甲基化使P16表达受阻，而用去甲基化试剂5脱氧aza胞嘧啶处理后，细胞系的有关基因可被再度激活。最近,王琼书等[24]研究了子宫内膜癌中P16基因CpG岛甲基化的情况，用PCR技术检测到P16基因在36例癌组织中有12例发生了第一外显子异常甲基化。各种肿瘤中，5'-CpG片段甲基化的发生频率并不相同，如鼻咽癌为22%，非何杰金淋巴瘤为15%～20%，而粘液性淋巴瘤可高达67%[25-26]。进一步的研究表明，P16基因纯合缺失的肿瘤细胞系(如胸部肿瘤、肾癌)和P16基因完整的肿瘤(如结肠癌、前列腺癌)均可发生5'-CpG片段的甲基化作用。杜鹃等[27]研究了肾癌中Pl6基因状态与肾癌的关系，33例癌组织中7例发生基因缺失，10例发生甲基化，未发现基因缺失与甲基化同时存在的病例，推测基因缺失和甲基化是P16失活的两种并列机理，甲基化可能是早期事件，而基因缺失是晚期事件，两者关系有待进一步研究。
另外，有研究表明：在某些肿瘤细胞中发生了染色体易位，也可导致P16基因的失活。
P16基因异常表达作为恶性肿瘤的一种发病机理越来越受到研究者的重视。Okamoto等[28]报道，在人肺、食管、肝、结肠和胰腺的肿瘤中有明显的P16与cyclinD1表达相反的现象，用P16的cDNA表达载体转染癌细胞，可有效地抑制癌细胞克隆的形成。相反，P16的缺失则导致癌细胞无限性生长。管金平等[29]应用SP免疫组化方法对160例胃癌和52例胃良性病变中P16蛋白的检测发现，P16蛋白在胃癌组织中阳性表达率为43.8%，胃良性病变中阳性表达率为69.2%，二者存在显著差异(P<0.05)，说明抑癌P16基因的缺失或过度甲基化或其他原因的低表达与胃癌的发生发展有关。卜保国等[30]应用免疫组化ABC法检测46例肝细胞癌及其癌旁组织中P16蛋白和丙型肝炎病毒抗原的表达，结果提示P16蛋白的表达缺失可能与肝细胞癌的发生发展及预后有关。尚贤文[31]采用免疫组化SP法标记70例大肠癌组织中抑癌基因P16，结果表明，P16基因的表达缺失与大肠癌的发生有关，并且与大肠癌的病理组织学分级、临床分期及预后有关。
3.3 联合检测Ki67和P16的异常表达与肿瘤的关系
王岩等[32]应用免疫组化技术研究P16蛋白的异常表达与宫颈癌的关系，研究结果表明宫颈癌与正常宫颈黏膜的P16表达有显著差异。P16蛋白在宫颈癌、非典型增生及宫颈正常粘膜中表达的递增，提示P16基因的缺失可能发生于宫颈癌发生机制中的早期阶段，并可能作为在宫颈癌前人群中筛选高危个体的标志物。在正常组织中仅1例发现Ki67表达，在宫颈上皮内肿瘤性病变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)-Ⅱ、Ⅲ级中Ki67的阳性表达率为10.5%，而在鳞癌中已上升到68.7%。等级相关分析结果显示，Ki67表达程度与组织学分级之间呈正相关(ｒ=0.5837，P<0.001)，提示细胞增殖活性的改变，在CIN-Ⅱ、Ⅲ级就部分发生增殖活性的改变与癌变的过程相关。研究还发现，P16蛋白与Ki67的表达间有很强的负相关性，提示异常增殖的细胞中可能有P16的缺失与突变。两者可能对细胞癌变具有相互促进作用。同时，综合分析P16蛋白与Ki67的异常表达与癌变过程的相关性，其显著性较单独者高(ｒ=0.6039，P<0.001)。提示两者联合起来作为筛选癌前高危个体的生物指标可能会更有意义。
4 问题与展望
Ki67是反映细胞增殖的核抗原,在细胞周期的G1后期、S期、G2期和M期细胞核表达,能很好地反映肿瘤增生活性。虽然Ki67的半衰期短，经高温组织抗原修复后，其免疫组化染色能检测肿瘤的增殖特征,可以很好地反映出肿瘤恶性程度，可作为评价细胞增殖状态的指标。抑癌基因P16能抑制细胞从G1期进入S期，对细胞的增殖起负调控作用，P16基因由于缺失或突变不能表达时，导致细胞呈失控性生长而形成肿瘤。两者联合起来鉴别肿瘤的良、恶性更有意义。有关Ki67和P16在肾上腺肿瘤组织表达的研究，经文献检索非常少见。而临床上肾上腺肿瘤确定良恶性比较困难，相应内分泌激素及代谢产物水平高低、影像检查对鉴别肿瘤良恶性意义不大，在形态学上也很难区别。联合检测Ki67和P16在肾上腺皮质肿瘤中的表达，研究Ki67及P16与肾上腺皮质肿瘤的关系，为临床上难以做出诊断的肾上腺皮质腺癌提供较为客观的诊断指标，具有较高的实用价值。
参 考 文 献
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在人类肿瘤组织表达的研究进展
Ki67抗原(Ki67 antigen)，简称为Ki67,是应用最广泛的增殖细胞标记之一。Ki67标记指数(labeling index，LI)是评估人类各种组织增殖组分的可靠而简便的方法，是目前已知的增殖抗原中最具增殖能力代表性的指标。现在Ki67的研究多用于评价细胞增殖活性、细胞周期与肿瘤的生长方式、浸润方式、复发、转移等生物学行为，即用于判断肿瘤的良、恶性及恶性程度。抑癌基因(tumor suppressor gene)P16是人类发现的第一个直接参与细胞周期调节的抑制基因，也是目前已知抑癌基因中唯一通过直接抑制细胞周期而抑制细胞生长的基因，当P16基因由于缺失或突变不能表达时，导致细胞呈失控性生长而形成肿瘤。近年来,关于Ki67和P16的异常表达与肿瘤发生发展关系的研究已成为肿瘤分子生物学研究的热点之一。下面就Ki67和ｐ16基因与人类肿瘤的关系研究进展综述如下。
1 Ki67
1.1 Ki67抗原和抗体的特征:
1.1.1 Ki67抗原
Ki67属于非组蛋白，对蛋白酶高度敏感，Ki67蛋白的结构包含200个以上的磷酸化部位，19个N豆蔻酰化部位，3个酰肽化部位及40个弱和10个强PETS区(富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸的区域)。PETS序列是蛋白易于降解的部位，这也是Ki67半衰期较短的原因。Ki67蛋白由相对分子质量为358761和319508的两条多肽链组成，由2个相连接的9768和8686bp的ｍRNA所编码。该cDNA含有14个内含子和15个外显子。第13外显子是其中心部位，长6845个bp，含有16个366bp的重复序列和1个62bp的保守序列，后者称为Ki67基元(motif)，编码Ki67的决定簇。Ki67存在两种cDNA型：长型和短型，因而Ki67蛋白在Western blot中呈现345000和395000两条区带。编码Ki67的人类基因定位于第10号染色体的长臂上(10q25)[1]。Ki67抗原的量随细胞周期的不同而发生改变。在G1中期到后期出现表达，S期和G2期逐渐增加，有丝分裂期达到高峰，分裂后迅速降解或丢失抗原决定簇，半衰期为1h或更短，且很难分离提取，限制了它在外周血标本的研究。Ki67的位置分布与细胞周期有关。对人胚胎肺细胞株的各种状态时Ki67分布情况的研究，有学者观察到细胞间期和分裂期Ki67的染色方式不同。G1后期位于细胞核周围区，S期均匀分布于核浆中，G2期除核周围仍存在外，核浆中出现混合型细小和斑点状颗粒。在分裂前期，Ki67位于核浆，分裂期位于胞质，且两个时期的染色体附近均有浓密分布，分裂后期和末期迅速消失。Ki67的功能与细胞的有丝分裂有关，它可能是染色质内部及周围的非组蛋白基质，可看作为染色体骨架，可能是具有结合特性的重要结构蛋白，在有丝分裂中起着维持DNA规则结构的重要作用[2]。
1.1.2 Ki67抗体
Ki67抗体(Ki67 antibody)是在1983年由Gerdes等用霍奇金瘤系Ｌ428细胞的粗核成分免疫鼠后首次制备出的鼠单克隆抗体，属于IgG1家族。当时的实验地点是在德国的Kiel城市，所用组织培养板的编号为67，由此而得名，对应的抗原命名为Ki67抗原。
1.2 Ki67的检测方法
以往大多应用Ki67抗体来检测Ki67。Ki67的半衰期仅1h左右，以前此种方法多局限在新鲜组织和冰冻切片的研究中。1991年Shi等[3]用组织切片在微波炉加热的技术恢复抗原决定簇，使福尔马林固定石蜡包埋的档案标本可行免疫组化染色。这种抗原恢复技术同样可恢复Ki67的免疫活性[4]，从而使Ki67广泛地应用于人类肿瘤细胞增殖活性的研究。
1.3 Ki67对肿瘤细胞增生程度的评价：
肿瘤细胞增生是否活跃直接影响着临床治疗方案的选择与预后。传统上判断肿瘤是否生长活跃是靠病理组织学观察细胞分裂象的多少来决定的，一般采用常规的形态指标(如肿瘤的浸润、转移、体积、核分裂象数、细胞异型性和肿瘤性坏死等)来划分肿瘤的性质。间质瘤的浸润和转移被认为是诊断恶性的确定指标。但由于计数不准确及影响因素太多而临床应用价值有限。通过Ki67的单克隆抗体以免疫组化对瘤细胞增殖抗原进行定位定量分析是最为简便、可靠的方法。这些肿瘤细胞增殖抗原已证明与许多肿瘤的预后有关，即Ki67阳性细胞多者，其恶性度增高，预后不良。众多研究已表明Ki67标记指数能可靠地反映正常和病变增殖活性，对许多良、恶性肿瘤的鉴别，可作为有参考价值的辅助指标,也有利于良性病变癌变可能性的预测，恶性肿瘤的早期诊断、治疗方法选择和疗效的评估。
2 P16基因
2.1 P16基因的发现及命名
P16是人类发现的第一个直接参与细胞周期调节的抑制基因，也是目前已知的抑癌基因中唯一通过直接抑制细胞周期而抑制细胞生长的基因。1992年，Beach等注意到：在黑色素瘤患者在第9号染色体存在1个黑色素瘤易感基因(tumor susceptibility gene )[5]；此后又发现，许多人类肿瘤细胞系中均有9号染色体短臂21～22(9p21-22)区域的异常，如纯合、杂合缺失或突变，故推测该区域内有肿瘤抑制基因存在。1993年，Serrano等[6] 克隆出此基因的cDNA，因其编码相对分子质量为16kd的蛋白质，故被命名为P16基因。P16基因的缺失与突变与多种肿瘤的发生有关,故命名为多肿瘤抑制因子(multiple tumor suppressor, MTS)。P16蛋白可与细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)结合，并抑制cyclinD/CDK4的活性,所以也叫作CDK4抑制因子(CDK4 inhibitor, CDK4I或P16ink4)[6]。
2.2 P16基因的结构
P16基因位于人类第9号染色体短臂2区1带(9p21)，全长8.5kb，由编码序列和两个内含子组成，编码序列从5'～3'被2个内含子分成三部分：5'区的126个碱基的外显子1,307个碱基的外显子2和3'区的11个碱基的外显子3[6]。1997年，黄长晖等[7]从Hela细胞中抽提总RNA，克隆了P16ink4基因的cDNA编码序列，其核苷酸序列及推测的氨基酸顺序如图1所示.
1 ATG GAG CCG GCG GCG GGG AGC AGC ATG GAG CCT TCG GCT GAC TGG CTG GCC ACG MET Glu Pro Ala Als Gly Ser Ser Met Glu Pro Ser Ala Asp Trp Leu Ala Thr
55 GCC GCG GCC CGG GGT CGG GTA GAG GAG GTG CGG GCG CTG CTG GAG GCG GGG GCG
Ala Ala Ala Arg Gly Arg Val Glu Glu Val Arg Ala Leu Leu Glu Ala Gly Ala
109 CTG CCC AAC GCA CCG AAT AGT TAC GGT CGG AGG CCG ATC CAG GTC ATG ATG ATG
Leu Pro Asn Ala Pro Asn Ser Tyr Gly Arg Arg Pro Ile Gln Val Met Met Met
162 GGC AGC GCC CGA GTG GCG GAG CTG CTG CTG CTC CAC GGC GCG GAG CCC AAC TGC Gly Ser Ala Arg Val Ala Glu Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Glu Pro Asn Cys
216 GCC GAC CCC GCC ACT CTC ACC CGA CCC GTG CAC GAC GCT GCC CGG GAG GGC TTC
Ala Asp Pro Ala Thr Leu Thr Arg Pro Val His Asp Ala Ala Arg Glu Gly Phe
270 CTG GAC ACG CTG GTG GTC CTG CAC CGG GCC GGG GCG CGG CTG GAC GTG CGC GAT Leu Asp Thr Leu Val Val Leu His Arg Ala Gly Ala Arg Leu Asp Val Arg Asp
324 GCC TGG GGC CGT CTG CCC GTG GAC CTG GCT GAG GAG CTG GGC CAT CGC GAT GTC
Ala Trp Gly Arg Leu Pro Val Asp Leu Ala Glu Glu Leu Gly His Arg Asp Val
378 GCA CGG TAC CTG CGC GCG GCT GCG GGG GGC ACC AGA GGC AGT AAC CAT GCC CGC
Ala Arg Tyr Leu Arg Ala Ala Ala Gly Gly Thr Arg Gly Ser Asn His Ala Arg
432 ATA GAT GCC GCG GAA GGT CCC TCA GAC ATC CCC GAT TGA AAG AAC CAG AGA GGC
Ile Asp Ala Ala Glu Gly Pro Ser Asp Ile Pro Asp —
486 TCT GAG AAA CCT CGG GAA ACT TAG ATC ATC AGT CAC CGA AGG TCC TAC AGG GCC (539)
图1 Hela细胞p16ink4cDNA序列及推断的氨基酸顺序
Fig.1 The sequence of p16ink4cDNA and the deduced order of amino acid in Hela cell
2.3 P16蛋白的生物学功能
P16蛋白是抑癌基因P16的表达产物。人类75%的癌细胞株有P16基因的缺失或突变，高于P53基因50%的突变率[8]，已经证实P16基因在黑色素瘤、肺癌、食管癌和白血病等中均存在频发的缺失和蛋白表达异常[9]。体外实验亦表明：用含有P16cDNA的载体转染癌细胞，可有效地抑制癌细胞克隆的形成。2000年，白雪源等[10]构建了复制缺陷型重组P16腺病毒，用纯化后的腺病毒感染人白血病细胞株HL-60后，在感染细胞中有外源性P16cDNA存在和P16蛋白表达，被感染的HL-60细胞的生长受到明显抑制，而对照腺病毒感染的细胞生长没有受到抑制，提示了P16与肿瘤抑制相关。也有研究报道在P16蛋白缺乏时肿瘤细胞的持续增殖能力可明显提高[11]，进一步证明了P16蛋白是一种抑癌蛋白。
2.4 P16调节细胞周期的作用机制
细胞周期调节依赖于一系列大分子蛋白质有序的活化与失活，以维持细胞的增殖和分化，保证机体的正常生长发育。细胞周期蛋白(cyclin，共有八种，以A~H来命名))和细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)促进细胞周期进展；而细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitor, CKI)则抑制细胞周期进程。CDK依赖其相应的cyclin配体使其激活，促进细胞增殖；而CKI通过抑制CDK的活性，抑制细胞增殖。P16蛋白作为一种CKI，能抑制细胞从G1期进入S期，对细胞的增殖起负调控作用。目前认为细胞周期的分子调控机制，涉及cyclin、CDK和CKI之间的相互作用，其中CDK的活性表达及调控尤为重要。真核细胞分裂必须通过G1期→S期的转换开始进行DNA合成，通过G2期→M期转换进入有丝分裂期，在这些转换过程中，CDK起着重要作用。CDK通过调节底物Rb(retinoblastoma)蛋白(是一种核磷蛋白, 分子量为110Ｋｄ)的磷酸化而促使G1→S和G2→M期的转换，导致细胞增殖。P16蛋白与cyclinD竞争结合CDK4，能够特异性抑制CDK4的活性从而阻止细胞从G1期进入S期，抑制细胞增殖；相反cyclinD与CDK4结合时，刺激细胞生长、分裂。当P16基因由于缺失或突变不能表达时，cyclinD与CDK4的结合占优势，过度刺激细胞分裂，细胞呈失控性生长，使在G1期未充分发育的细胞提前进入S期而形成肿瘤[12]。
3 Ki67和P16与人类肿瘤
3.1 Ki67与人类肿瘤
Ki67是反映细胞增殖的核抗原,在细胞周期的G1后期、S期、G2期和M期细胞核表达，其免疫组化染色能检测肿瘤的增殖特征，与肿瘤恶性程度、浸润性、转移、复发密切相关，能准确反映出肿瘤的性质〔13〕。
I Kenaga等[14]研究了绒毛状大肠腺瘤(VT)和管状大肠腺瘤(TT)、大肠癌的增殖及凋亡情况，认为随管状腺瘤不典型增生程度的加重，越接近于癌组织，其Ki67标记指数越高。Krecicki等运用免疫组化技术研究154例喉鳞癌中Ki67抗原表达情况，57%阳性表达，Ki67的表达在正常组与癌症组之间有明显不同，有助于区别喉表皮增生的良恶性[15]。郭贵龙等[16]研究认为：Ki67在正常组织中几乎不表达, 甲状腺滤泡状腺癌的Ki67表达最高, 甲状腺滤泡状腺瘤的表达次之；随着甲状腺恶性程度的增加，Ki67的表达依次增高。甲状腺滤泡状腺瘤与滤泡状腺癌相比较，两者的Ki67标记指数差异有极显著性意义，认为Ki67可作为评价甲状腺滤泡状肿瘤增殖度的指标。杨亦萍等[17] 的报告也认为：Ki67抗原的表达有助于良恶性甲状腺滤泡肿瘤的鉴别。
3.2 P16基因异常与肿瘤的关系
人类肿瘤中P16基因的变异形式多样，主要形式有以下几种:
第一、基因缺失或突变：包括纯合缺失、杂合缺失、基因内碱基缺失、点突变。在绝大部分肿瘤中P16基因缺失或突变具有下列特点[18]:
(1)缺失发生频率高于基因突变，缺失及突变的部位主要集中在外显子2上，有纯合缺失和杂合缺失、移码突变和点突变等多种形式。Kamb等[19]研究了来源于肺、脑、骨、皮肤、膀胱、肾、卵巢等的近300个肿瘤细胞株，纯合及杂合缺失占50%，碱基突变或缺失占25%，并且他认为纯合性缺失是P16基因失活的优势方式，而点突变可能不是失活的主要方式。2001年李淑锋等[20]采用双重PCR、PCR-SSCP和序列分析方法，对31例非小细胞肺癌、15例食管癌、13例胃癌、9例乳腺癌共68例原发肿瘤组织标本的P16基因进行了研究，结果显示P16基因在肺癌、食管癌、胃癌、乳腺癌中的缺失率分别为16%、20%、8%、0；仅有2例突变，1例食管癌在第130位氨基酸密码由AGA变为ATA，编码的氨基酸由精氨酸变为异亮氨酸，1例肺癌第140位氨基酸的CGC处的C缺失，导致移码突变。
(2)基因缺失、突变在肿瘤细胞株中高于相应的原发实体瘤。有学者认为, P16基因缺失、突变可能是细胞培养过程引起的，Kamb[19]等则认，原发实体瘤中缺失及突变率低是由于实体瘤中含有的正常细胞干扰了P16基因的检测。
第二、甲基化(methylation)：P16基因突变和缺失具有肿瘤类型的倾向性，但在某些肿瘤中其突变和缺失较少见，是由于P16基因上游CpG岛的甲基化和含有P16基因片段的染色质浓缩所致。P16基因过度甲基化时，抑制基因mRNA转录，导致该基因失活。据James等[21]报道，5'-CpG的甲基化是P16阻抑的重要方式，这一现象频繁地发生于胸部肿瘤(33%)、前列腺癌(60%)、结肠癌(90%)、肾癌(23%)，以及非小细胞肺癌、神经胶质瘤和头颈部肿瘤中[22]。5'-CpG片段是P16的启动子区域，与转录有关[23]，其甲基化使P16基因的转录受到抑制，在人类肾细胞癌中异常的甲基化使P16表达受阻，而用去甲基化试剂5脱氧aza胞嘧啶处理后，细胞系的有关基因可被再度激活。最近,王琼书等[24]研究了子宫内膜癌中P16基因CpG岛甲基化的情况，用PCR技术检测到P16基因在36例癌组织中有12例发生了第一外显子异常甲基化。各种肿瘤中，5'-CpG片段甲基化的发生频率并不相同，如鼻咽癌为22%，非何杰金淋巴瘤为15%～20%，而粘液性淋巴瘤可高达67%[25-26]。进一步的研究表明，P16基因纯合缺失的肿瘤细胞系(如胸部肿瘤、肾癌)和P16基因完整的肿瘤(如结肠癌、前列腺癌)均可发生5'-CpG片段的甲基化作用。杜鹃等[27]研究了肾癌中Pl6基因状态与肾癌的关系，33例癌组织中7例发生基因缺失，10例发生甲基化，未发现基因缺失与甲基化同时存在的病例，推测基因缺失和甲基化是P16失活的两种并列机理，甲基化可能是早期事件，而基因缺失是晚期事件，两者关系有待进一步研究。
另外，有研究表明：在某些肿瘤细胞中发生了染色体易位，也可导致P16基因的失活。
P16基因异常表达作为恶性肿瘤的一种发病机理越来越受到研究者的重视。Okamoto等[28]报道，在人肺、食管、肝、结肠和胰腺的肿瘤中有明显的P16与cyclinD1表达相反的现象，用P16的cDNA表达载体转染癌细胞，可有效地抑制癌细胞克隆的形成。相反，P16的缺失则导致癌细胞无限性生长。管金平等[29]应用SP免疫组化方法对160例胃癌和52例胃良性病变中P16蛋白的检测发现，P16蛋白在胃癌组织中阳性表达率为43.8%，胃良性病变中阳性表达率为69.2%，二者存在显著差异(P<0.05)，说明抑癌P16基因的缺失或过度甲基化或其他原因的低表达与胃癌的发生发展有关。卜保国等[30]应用免疫组化ABC法检测46例肝细胞癌及其癌旁组织中P16蛋白和丙型肝炎病毒抗原的表达，结果提示P16蛋白的表达缺失可能与肝细胞癌的发生发展及预后有关。尚贤文[31]采用免疫组化SP法标记70例大肠癌组织中抑癌基因P16，结果表明，P16基因的表达缺失与大肠癌的发生有关，并且与大肠癌的病理组织学分级、临床分期及预后有关。
3.3 联合检测Ki67和P16的异常表达与肿瘤的关系
王岩等[32]应用免疫组化技术研究P16蛋白的异常表达与宫颈癌的关系，研究结果表明宫颈癌与正常宫颈黏膜的P16表达有显著差异。P16蛋白在宫颈癌、非典型增生及宫颈正常粘膜中表达的递增，提示P16基因的缺失可能发生于宫颈癌发生机制中的早期阶段，并可能作为在宫颈癌前人群中筛选高危个体的标志物。在正常组织中仅1例发现Ki67表达，在宫颈上皮内肿瘤性病变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)-Ⅱ、Ⅲ级中Ki67的阳性表达率为10.5%，而在鳞癌中已上升到68.7%。等级相关分析结果显示，Ki67表达程度与组织学分级之间呈正相关(ｒ=0.5837，P<0.001)，提示细胞增殖活性的改变，在CIN-Ⅱ、Ⅲ级就部分发生增殖活性的改变与癌变的过程相关。研究还发现，P16蛋白与Ki67的表达间有很强的负相关性，提示异常增殖的细胞中可能有P16的缺失与突变。两者可能对细胞癌变具有相互促进作用。同时，综合分析P16蛋白与Ki67的异常表达与癌变过程的相关性，其显著性较单独者高(ｒ=0.6039，P<0.001)。提示两者联合起来作为筛选癌前高危个体的生物指标可能会更有意义。
4 问题与展望
Ki67是反映细胞增殖的核抗原,在细胞周期的G1后期、S期、G2期和M期细胞核表达,能很好地反映肿瘤增生活性。虽然Ki67的半衰期短，经高温组织抗原修复后，其免疫组化染色能检测肿瘤的增殖特征,可以很好地反映出肿瘤恶性程度，可作为评价细胞增殖状态的指标。抑癌基因P16能抑制细胞从G1期进入S期，对细胞的增殖起负调控作用，P16基因由于缺失或突变不能表达时，导致细胞呈失控性生长而形成肿瘤。两者联合起来鉴别肿瘤的良、恶性更有意义。有关Ki67和P16在肾上腺肿瘤组织表达的研究，经文献检索非常少见。而临床上肾上腺肿瘤确定良恶性比较困难，相应内分泌激素及代谢产物水平高低、影像检查对鉴别肿瘤良恶性意义不大，在形态学上也很难区别。联合检测Ki67和P16在肾上腺皮质肿瘤中的表达，研究Ki67及P16与肾上腺皮质肿瘤的关系，为临床上难以做出诊断的肾上腺皮质腺癌提供较为客观的诊断指标，具有较高的实用价值。
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