【求助】目的基因原先能扩出，现在却不出了，怎么办啊？

各位大侠好:
小妹最近在做RT－PCR，好不容易摸出条件有几个标本出了目的带，现在换了标本，又不出带了（内参都能出的），好苦恼啊！条件都一样，同一台PCR仪，引物今天也跑过电泳了，没有降解。我下一步该怎么办啊？大家帮帮我吧，小妹先谢过了。
我的PCR反应体系如下(25ul）：
10×BUFFER：2、5ul
Mgcl2：1、5ul
dNTP：0、5ul
Taq酶：0、2ul
上下游引物各1、25ul
模板：4ul（3ul，5ul，6ul）
PCR水：
由于我提出来的RNA无法测浓度（实验室条件所限），所以我每次反转录时RNA都是加5ul，但是内参都出的挺好，目的基因一开始也出来了，最近却不出了，有的时候PCR时模板量都摸4、5、6ul也不出目的带（之前有的标本这个量都出带了），我下一步该怎么调整啊？大家帮帮我吧，指点一下！谢谢各位了！