氢水通过上调核因子红细胞2相关因子2/血红素加氧酶1表达抑制顺铂致肝细胞损伤作用研究
肝脏在药物代谢中起着重要作用，药物性肝损伤是临床用药中的常见不良反应，其发病率高且发病隐匿，严重时可致患者死亡［1］。我国药物性肝损伤发病率约为23.80/10万［2］，其中化疗药物的使用是引发药物性肝损伤的重要诱因［3］。顺铂作为临床常用广谱化疗药物疗效显著，但毒副作用强，易造成药物性肝损伤［4］。调查发现药物性肝损伤的主要机制与活性氧（reactiveoxygen species, ROS）的积累引起的氧化应激水平增高有关［5］。因而如何降低或抑制ROS的产生，从而预防药物性肝损伤的发生是目前临床关注的热点。
氢是自然界最小的分子，具有良好的抗氧化性，能选择性地清除氧自由基，减少氧化损伤［6］。Korovljev等［7］发现非酒精性脂肪性肝病患者饮用氢水后肝损伤相关生物标志物水平下降，提出饮用氢水可能成为非酒精性脂肪性肝病的一种辅助治疗方法。课题组前期研究证实氢水可通过提高机体抗氧化能力，缓解大鼠因高糖高脂饮食造成的肝损伤［8］，由此可推测氢水在顺铂导致的药物性肝损伤中可发挥保护作用，但其作用效果和机制尚未明确。本研究将氢水与顺铂联合使用，探究氢水对顺铂引发肝细胞氧化应激性损伤的保护作用及机制，以期为氢水用于顺铂致药物性肝损伤的预防以及临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 研究时间
2022年6月—2023年6月。
1.2 细胞与试剂
人正常肝细胞WRL68（北京百欧博伟生物技术有限公司，货号：bio-53604）；顺铂（美国Sigma-Aldrich公司，货号：P4394）；RPMI-1640培养基干粉（美国Gibco公司，货号：31800-022）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，货号：11011-6125）；CCK-8试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：CA1210）；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）凋亡检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：CA1020）；线 粒 体 膜 电 位（mitochondrial membrane potential, MMP）检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号：C2008S）；ROS试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号：S0033S）；兔抗核因子红细胞 2 相关因子 2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, NFE2L2）（ 美 国 Affinity Biosciences公司，货号：AF0639）；兔抗血红素加氧酶 1（hemeoxygenase-1, HMOX1）（美国 Affinity Biosciences 公司，货号：AF5393）；兔抗肌动蛋白β（ACTB）（美国Affinity Biosciences公司，货号：AF7018）；山羊抗兔IgG（美国Affinity Biosciences公司，货号：S0001）；NFE2L2、HMOX1及ACTB引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。
1.3 主要仪器
氢水机（深圳市创辉氢科技发展有限公司，型号：CHD-1）；酶标仪（美国Bio-Rad公司，型号：iMark）；垂直电泳仪（美国Bio-Rad公司，型号：PowerPac Basic）；荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司，型号：CFX96）；化学发光成像仪（美国Cytiva公司，型号：AI800）；流式细胞仪（美国BD公司，型号：FACSLyric）；高内涵成像分析系统（美国Molecular Devices公司，型号：ImageXpress Micro 4）。
1.4 方法
1.4.1 药液配制
将顺铂用0.9%氯化钠溶液溶解至浓度为1 g/L的母液，避光保存。临用前将其用RPMI-1640完全培养基稀释成相应浓度的工作液进行细胞培养。
1.4.2 顺铂致肝细胞损伤模型的建立
将处于对数期的WRL68细胞接种于96孔板中，将细胞分为对照组和实验组，对照组顺铂浓度为0，实验组设置顺铂浓度为1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mg/L
共5个亚组，每组/亚组设置3个复孔，5×103 个细胞/孔。每组先用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基100 μL培养24 h，更换含相应浓度顺铂的培养基继续培养24 h后，加入10 μL CCK-8试剂，继续培养2 h，用酶标仪检测450 nm处吸光度值（OD），按以下公式计算细胞活力：细胞活力=［（OD 实验组-OD空白）/（OD 对照组-OD空白）］×100％，OD空白为只含有培养基和CCK-8试剂孔的吸光度。选择细胞活力为60%左右的顺铂浓度作为建立肝细胞损伤模型的药物浓度。
1.4.3 氢水培养基制备与氢浓度的确定
按照张昭等［9］的方法制备氢水，顶空气相色谱法测定氢浓度。将RPMI-1640培养基干粉溶解于氢水中，加入10%胎牛血清，配制氢浓度分别为0.6、0.9、1.2 mg/L的氢水培养基。将处于对数期的WRL68细胞分为：对照组、顺铂组、低浓度氢水组、低浓度氢水+顺铂组、中浓度氢水组、中浓度氢水+顺铂组、高浓度氢水组、高浓度氢水+顺铂组，于96孔板培养。对照组和顺铂组用RPMI-1640完全培养基培养，低浓度氢水组和低浓度氢水+顺铂组用0.6 mg/L氢水培养基培养，中浓度氢水组和中浓度氢水+顺铂组用0.9 mg/L氢水培养基培养，高浓度氢水组和高浓度氢水+顺铂组用1.2 mg/L氢水培养基培养。各组培养24 h后，顺铂组、低浓度氢水+顺铂组、中浓度氢水+顺铂组、高浓度氢水+顺铂组加入3 mg/L顺铂继续培养24 h后测定细胞活力，具体方法参照1.4.2。选取各氢水+顺铂组中细胞活力最高的组所对应氢水浓度建立氢水预保护模型。
1.4.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率
将处于对数期的WRL68细胞分为4组：对照组、顺铂组、氢水组、氢水+顺铂组，按照1.4.3培养方案进行细胞培养48 h。收集各组细胞，制备单细胞悬液并调整密度为1×106个/mL。取100 µL细胞悬液于流式管，加入5 µL Annexin V-FITC混匀后置于室温避光孵育5 min，加入5 µL碘化丙啶（PI）和400 µL 磷酸盐缓冲液，于流式细胞仪检测细胞凋亡，使用FlowJo 10.9.0软件分析细胞凋亡率。
1.4.5 细胞内MMP和ROS检测
按照1.4.4方案培养细胞48 h后，分别向各组细胞培养孔加入罗丹明123（1∶1 000）和2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）荧光探针（1∶1 000），37 ℃避光孵育30 min后充分洗涤细胞3次，用高内涵成像分析系统检测各组细胞荧光强度，分析细胞内MMP和ROS水平。
1.4.6 Western blotting法检测细胞内NFE2L2与HMOX1的蛋白水平
按照1.4.4方案培养细胞48 h后收集各组细胞，按照每1×106个细胞加入200 μL裂解液充分裂解细胞，12 000 ×ｇ离心5 min，取上清进行蛋白浓度测定。按1∶4比例加入蛋白上样缓冲液后，100 ℃水浴加热10 min，冷却至室温后10 000×g离心5 min，取上清液进行电泳。将蛋白转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h后加入NFE2L2（1∶2 000）、HMOX1（1∶2 000）、肌动蛋白β（ACTB）（1∶5 000）一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后加入二抗（1∶5 000），室温孵育1 h。充分洗膜后加入增强型化学发光（ECL）试剂，化学发光成像仪采集图像，Image J 1.53分析软件分析NFE2L2与HMOX1的蛋白水平。
1.4.7 RT-qPCR法检测细胞内NFE2L2与HMOX1的mRNA水平
按照1.4.4方案培养细胞48 h后收集各组细胞，提取总RNA，按照说明书进行反转录和PCR反应。PCR反应体系为20 μL，反应条件为：95 ℃预变性5 min、95 ℃变性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，扩增40个循环，采用2-∆∆Ct法计算mRNA相对表达量。
1.5 统计学方法
采用GraphPad 9.0.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同浓度顺铂对肝细胞活力的影响
采用CCK-8法检测WRL68细胞活力，结果显示：对照组与顺铂1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mg/L亚组WRL68细胞活力比较，差异有统计学意义（P<0.05）；其中顺铂1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mg/L亚组WRL68细胞活力均低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。经计算用3 mg/L顺铂干预24 h后，细胞活力为（61.91±2.10）%，后续实验均采用3 mg/L顺铂浓度建立肝细胞损伤模型。
2.2 不同浓度氢水干预对肝细胞活力的影响
采用CCK-8法检测不同浓度氢水干预后肝细胞活力，结果显示：对照组、顺铂组、低浓度氢水组、低浓度氢水+顺铂组、中浓度氢水组、中浓度氢水+顺铂组、高浓度氢水组、高浓度氢水+顺铂组WRL68细胞活力比较，差异有统计学意义（P<0.05）；其中低、中、高浓度氢水组WRL68细胞活力与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；顺铂组WRL68细胞活力低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；低浓度氢水+顺铂组、中浓度氢水+顺铂组、高浓度氢水+顺铂组WRL68细胞活力高于顺铂组，差异有统计学意义（P<0.05）。后续实验选用0.6 mg/L氢水预处理建立氢水预保护模型。
2.3 氢水对顺铂致肝细胞凋亡的抑制作用
流式细胞仪检测肝细胞凋亡结果显示：对照组、顺铂组、氢水组、氢水+顺铂组WRL68细胞凋亡率比较，差异有统计学意义（P<0.05）；其中顺铂组、氢水+顺铂组WRL68细胞凋亡率高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；氢水组、氢水+顺铂组WRL68细胞凋亡率低于顺铂组，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.4 氢水通过提高肝细胞MMP和降低ROS水平抑制顺铂诱导的肝细胞凋亡
光镜下观察各组细胞结果显示：对照组和氢水组细胞贴壁状态良好，形态为不规则多角形；顺铂组细胞变圆，贴壁数量减少，死细胞增多。与顺铂组相比，氢水+顺铂组细胞贴壁数量增多，死细胞减少。
肝细胞MMP和ROS水平检测结果显示：对照组、顺铂组、氢水组、氢水+顺铂组MMP、ROS荧光强度比较，差异有统计学意义（P<0.05）；其中与对照组相比，顺铂组、氢水+顺铂组MMP荧光强度降低，氢水组MMP荧光强度升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与顺铂组相比，氢水组、氢水+顺铂组MMP荧光强度升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与对照组相比，顺铂组、氢水+顺铂组ROS荧光强度升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与顺铂组相比，氢水组、氢水+顺铂组ROS荧光强度降低，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.5 氢水通过上调NFE2L2/HMOX1表达，降低顺铂对NFE2L2/HMOX1信号通路的抑制作用
对照组、顺铂组、氢水组、氢水+顺铂组WRL68细胞NFE2L2、HMOX1的蛋白和mRNA水平比较，差异有统计学意义（P<0.05）；其中与对照组相比，顺铂组NFE2L2与HMOX1的蛋白和mRNA水平均降低，差异有统计学意义（P<0.05）；氢水组NFE2L2与HMOX1的蛋白和mRNA水平均升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与顺铂组相比，氢水+顺铂组NFE2L2与HMOX1的蛋白和mRNA水平均升高，差异有统计学意义（P<0.05）。
3 讨论
药物性肝损伤是肿瘤患者化疗常见的毒副作用之一，使用化疗药物的同时如何预防和减轻药物性肝损伤已成为目前临床迫切需要解决的问题。顺铂作为一线化疗药物，其抗癌作用强，抗肿瘤活性达60%以上［10］。顺铂的抗癌活性源于其细胞毒性作用，长期使用可造成肝、肾、心脏等多脏器组织损伤［4］。研究证实，顺铂对肝脏的损伤主要通过诱导氧化应激、细胞凋亡以及炎症等途径［11］。氢作为选择性抗氧化剂，在调节细胞氧化还原平衡、代谢和诱导针对细胞应激的适应性反应中发挥着关键作用［12］。因此，将氢应用于药物性肝损伤的临床辅助治疗具有重要意义。
回顾既往氢临床试验，Xia等［13］认为慢性乙型肝炎患者饮用氢水后，肝脏氧化应激损伤有所改善。一项随机双盲临床对照试验发现，吸入氢/氧混合气体可通过激活肝细胞自噬，改善血脂和肝酶，缓解中重度非酒精性脂肪性肝病患者氧化应激和炎症相关指标［14］。动物实验表明，腹腔注射外源性氢气可通过抑制肝脏c-Jun氨基端激酶（JNK）活化减少肝细胞凋亡来缓解急性酒精性肝损伤［15］。本研究通过顺铂致肝细胞损伤模型研究发现，氢水能抑制顺铂诱导的肝细胞凋亡而不影响正常肝细胞活力，表明氢水对顺铂所致的肝细胞损伤具有保护作用。
根据富氢包装饮用水标准规定，饮用氢水中氢含量不低于0.5 mg/L［16］。本研究中采用0.6、0.9 mg/L和1.2 mg/L 3个浓度氢水进行实验，发现3个浓度氢水对正常肝细胞存活率影响无显著差异。Rahman 等［17］研究认为0.08 /1 000 000的氢含量与饱和氢水（1.5/1 000 000）所产生的效果无异，本研究结果与之一致。Zhang等［18］研究氢水对3种人结肠癌细胞的抑制作用时发现，3种细胞在氢的浓度和作用时间依赖性方面具有显著差异，但在72 h内，3种细胞均未表现出明显的氢浓度依赖性。本研究利用低、中、高3种浓度氢水分别预处理肝细胞，发现低浓度氢水+顺铂组肝细胞存活率最高，这一结果同样说明氢水抑制顺铂致肝细胞损伤时对氢浓度无显著依赖性，但具体原因还需进一步研究。
正常生理状态下，ROS的产生和清除处于动态平衡。当机体发生氧化应激时，大量的ROS在线粒体内生成，破坏线粒体膜的完整性。其中，毒性最强的是羟自由基和过氧亚硝基阴离子。研究证实，因药物引起的氧化应激导致线粒体功能障碍是产生肝损伤的重要病理机制，而MMP降低是导致细胞死亡的重要因素［19］。氢具有良好的扩散能力，可迅速穿过细胞膜到达线粒体发挥其抗氧化作用。Ohsawa等［20］认为氢可选择性清除毒性羟自由基和过氧亚硝基阴离子，其他参与机体信号转导的ROS则不受影响。Sumbalová等［21］通过临床试验发现非酒精性脂肪性肝病患者饮用氢水后血小板线粒体水平的变化最为显著，证明线粒体可能是氢的主要细胞内作用靶点。本研究发现，氢水能抑制顺铂诱导的肝细胞ROS升高，提高肝细胞的MMP水平，该结果进一步证明氢能通过降低氧化应激水平，对肝细胞线粒体功能发挥保护作用，从而降低顺铂所致的肝细胞损伤。
NFE2L2/HMOX1是调控机体氧化应激的主要因子，研究证实NFE2L2/HMOX1通路的激活在保护药物性肝炎的动物模型中发挥重要的作用［22］。生理状态下，NFE2L2与Kelch样ECH相关蛋白1（KEAP1）结合后发生泛素化并降解。当发生氧化应激时，ROS干扰NFE2L2泛素化使之易位至细胞核，与小肌肉筋膜纤维肉瘤（sMaf）蛋白形成异二聚体后与靶基因的抗氧化反应元件结合，诱导相应基因表达。本研究中肝细胞经顺铂处理后，NFE2L2与HMOX1的蛋白和mRNA水平降低，提示顺铂诱导的肝细胞氧化应激损伤与NFE2L2/HMOX1通路有关。氢水预处理可使细胞NFE2L2与HMOX1的蛋白和mRNA水平升高，说明氢水可通过激活NFE2L2/HMOX1通路对顺铂诱导的肝细胞毒性发挥保护作用，这一研究结果进一步从分子水平上证实氢水在预防和治疗肝脏氧化损伤方面具有潜在的应用价值。
综上所述，氢水可明显改善顺铂所致的肝细胞氧化应激损伤，其作用机制是通过激活细胞NFE2L2/HMOX1通路，提升肝细胞MMP水平实现的。本研究结果为氢水用于临床预防和辅助治疗药物性肝损伤提供了实验依据，但这一结果还需要在动物模型和临床中进行验证，从而为氢水在药物性肝损伤的预防及临床治疗提供更多依据。
参考文献略
