综述 :肿瘤多药耐药的机制及逆转

肿瘤多药耐药的机制及逆转
肿瘤细胞对多种化学药物产生交叉耐药性,称多药耐药(MDR),是造成肿瘤化学药物治疗（化疗）失败的主要原因.统计表明,肿瘤年死亡率中,属内在性多药耐药(intrinsicMDR)的肿瘤,包括消化器官、呼吸系统、泌尿系统以及中枢神经系统肿瘤引起的约占61％;属获得性多药耐药(acquired MDR)的肿瘤,包括皮肤癌、乳腺癌、生殖器癌、内分泌肿瘤、白血病和淋巴瘤,约占33％.这就是说,90%以上肿瘤患者死因都与耐药有关.另一方面,新发现的药物如紫杉醇和治疗慢性粒性白血病的STI-571,都是刚用于临床就发现有耐药性,这使问题更加严重.因此,肿瘤耐药基因的表达和逆转MDR的研究成为肿瘤治疗亟待解决的问题.
肿瘤多药耐药的发生机制:关于天然耐药性产生的原因尚未完全阐明.根据肿瘤细胞的耐药特点,耐药可分为原药耐药(PDR)和（MDR）两大类.前者指只对诱导药物产生耐药性而对其他药物不产生交叉耐药性;后者则是指肿瘤细胞一旦对某种化疗药物产生耐药性,同时对其它结构上无关,作用机理各异的药物也产生交叉耐药,这使一种独特的广谱耐药现象.许多天然来源的抗肿瘤药物如生物碱类抗癌药物(秋水仙碱、长春碱、三尖杉酯碱和酯杉醇等),蒽环类抗癌抗生素(阿霉素和柔红霉素),表鬼臼毒素类(Vp-16和VM-26)及合成药(米托蒽醌和胺苯丫啶)都极易发生MDR。有关MDR形成机制近年来已成为国内外学者研究的热点之一。目前认为,肿瘤耐药机制主要有:(1)药理耐药(pharmacological resistance):是指由机体对药物的影响所导致的耐药,如药物进入机体代谢增强或活化障碍、肿瘤血供不足、药物组织穿透力差、药物避难所的形成等,导致肿瘤细胞外有效浓度降低.(2)生化耐药(biochemical resistance):是指肿瘤细胞的遗传性及生化特性发生复杂的变化,致使细胞通过不同途径对药物产生耐药性.(3)凋亡耐药(atoptosis resistance):大部分抗肿瘤药物引起细胞死亡是通过细胞凋亡,而促凋亡基因的缺失或抗凋亡基因的过度表达都将相应地导致肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性.现在认为PCD(programmed cell death )调节基因的突变导致PCD功能的失常也是肿瘤细胞产生耐药性的机制之一.(4) 细胞动力学耐药:决定化疗方案成功与否的主要因素,除生物化学调控的耐药性外,亦与肿瘤体积、生长速度及药物计量有关.质膜在细胞内药物聚集、流入和流出方面起了重要的控制作用。Huang等［1］对质膜磷脂在MDR肿瘤细胞凋亡过程中的变化进行了研究，结果可能表明MDR现象的分子机制。除了脂质信号改变外，谷氨酰胺和肌醇的含量可能也随细胞凋亡而变化。但研究最广泛的机制是细胞将药物泵出的膜转运蛋白.这些膜转运蛋白降低了多药耐药肿瘤细胞内抗肿瘤药物的积累和滞留,使药物浓度低于治疗浓度的阈值,因而限制了肿瘤细胞的杀灭[2].转运蛋白另一机制是将细胞毒抗肿瘤药远离作用位点而在细胞内重分布.这种情况,尽管细胞内药物总浓度未降低,但这种药物的异常分布限制了药物对细胞内靶点的作用[3].另外,这些转运蛋白通过抑制MDR肿瘤细胞多种形式的凋亡的发生而产生多药耐药。转运蛋白还有影响细胞内PH值、细胞膜的通透性和目前能检测到的药物向细胞内的流入情况等。分子水平的研究，已能分离和描述多种转运蛋白基因编码，这些转运蛋白包括p-糖蛋白（p-gp）、多药耐药相关蛋白（MRP）、肺耐药蛋白（LRP）和乳腺癌耐药蛋白（BCRP）。利用MDR抑制物来阻碍转运蛋白药物泵出作用的策略，目前正处于不同的研究阶段。
1.1 p-gp  
MDR转运蛋白的研究最深入的是p-gp。Juiao等于1976年在中国仓鼠的卵巢细胞秋水仙素耐药株中首先发现，具有MDR表型的细胞膜上有一种分子量为170kD的糖蛋白高度表达，并发现该糖蛋的表达和细胞膜的通透性、细胞内药物浓度以及细胞耐药程度有关，称之为p-gp。p-gp由1200个氨基酸组成，定位于7号染色体的q21.1带上的MDR1基因。完整的P-gp分子共有12个跨膜疏水区和2个ATP结合位点，在膜内以二聚体或四聚体方式存在。这种p-gp跨膜结构具有能量依赖性“药泵”的功能，它能将抗癌药物和其它疏水性化合物主动转运出细胞［4］。由p-gp泵转运的其他药物还有心血管药物如钙离子通道拮抗剂，和抗病毒蛋白酶的抑制剂等。以上有些药物已被用来修饰p-gp。其机制可能是通过竞争抑制作用或改变p-gp的原子空间排列顺序。p-gp的底物包括蒽环类、长春碱、表鬼臼毒素、紫杉醇和其它天然产物。P-gp在正常胆管、肾、小肠、肾上腺、造血干细胞等均有表达，负责激素运输及排泌毒物等生理功能。最近研究显示,p-gp和MRP可能在血脑屏障（blood –brain barrier,BBB）和脉络丛的血脑脊屏障处起药物转运作用。这种作用可能涉及诸如抗抑郁药、抗精神病药、各种化疗药物和抗病毒蛋白酶的抑制剂的渗透和药代动力学等方面。当正常细胞演变成恶性细胞时，仍继续表达MDR1，因此临床上来源于这些组织的肿瘤，对初始化疗就具有耐药性，此为天然耐药性。而食管癌、胃癌、乳腺耐、非小细胞肺癌、膀胱癌、卵巢癌、造血系统恶性肿瘤等则属化疗前p-gp低表达的肿瘤。有研究显示，初治原发性恶性肿瘤p-gp表达明显低于转移复发性恶性肿瘤，说明一方面可能是癌细胞生物学行为进一步恶化的标志，另一方面表明，有些恶性肿瘤中MDR1基因是因应用抗癌药物治疗而诱导的过度表达。P-gp高表达的肿瘤病人常伴预后不良，如低缓解率、高复发率、生存期短，可作为预后评价指标。
1.2 MRP
MRP属ABC转运蛋白超家族成员，早在1992年由Cole等在一株对阿霉素耐药的小细胞肺癌细胞系H69／AR中最先发现的。MRP基因定位于16号染色体p13.1带上，由6500bp组成，编码1531个氨基酸的跨膜糖蛋白，分子量为190kD。近年来,MRP家族的其它成员相继被发现.MRP2的基质特异性类似于MRP1[5],MRP3是MRP1最相似的同系物[6],它也能够转运几种抗肿瘤药物[7].虽然MRP家族的其它成员在肿瘤多药耐药的作用还未建立,但最近发现MRP4和MRP5能够调节核苷类似物的转运[8, 9].MRP1在正常组织及肿瘤组织中广泛存在，是引起多药耐药的因素之一［10］。其多药耐药作用与p-gp的表达无关，但两者同属于膜转运蛋白多基因家族，与细胞内MRP的药物泵作用及其引起细胞内药物浓度降低有关。由MRP介导的耐药谱除酯杉醇和米托蒽醌外，十分类似于p-gp。文献报道的由MRP机制引起多药耐药的肿瘤包括乳腺癌、宫颈癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、食管癌、纤维肉瘤、神经母细胞瘤等。最近，ICHIHASHI等［11］在研究恶性黑素瘤的耐药性时发现，化疗前患者体内就已存在相当的MRP基因转录的mRNA，且在化疗后MRP水平显著升高，但未发现p-gp的升高。并由此得出MRP在恶性黑素瘤的多药耐药中起了重要作用。MRP在肿瘤细胞株上的过度表达是由于这些细胞的原生质囊泡中依赖ATP的谷胱甘肽S结合载体（glutathione-S-conjugate carrier）活性提高的缘故，谷胱甘肽S结合的输出载体又称为“GS-X泵”，它可将阴离子的共轭物排泄出细胞，并在清除外源性毒素中发挥作用.MRP能介导药物中的谷胱甘肽硫共轭物、葡萄糖醛酸甙共轭物和硫酸盐共轭物排出细胞;它也是内原性白三烯(LTC4)的主要运输器和免疫反应的重要介质;假如细胞含有正常水平的谷胱甘肽,它甚至能排出中性和碱性有机化合物的复合物.MRP转运的步骤可能为：GSH合成→GSH与药物偶和→MRP将药物泵出细胞外。MRP不但定位于血浆细胞膜，而且存在于内质网、高尔基滤泡处，提示MRP还可在细胞内隔离药物，使药物不能与靶位点结合，从而间接导致耐药［12］。通过谷胱甘肽合成酶抑制剂(buthionine sulfoximine,BSO)减少细胞内的谷胱甘肽，能完全逆转由MRP cDNA转染的癌细胞对阿霉素、柔红霉素、长春新碱和足叶已甙(etoposide,Vp-16)的耐药。谷胱甘肽的减少可降低MRP转染细胞中柔红霉素的流出，而在MDR1转染的细胞中无此现象，提示MRP对药物的转运作用与细胞内谷胱甘肽水平的特异性相关。因此，MRP可通过促进谷胱甘肽结合药物从细胞内的排出而致多药耐药。
1.3 LRP
肺耐药蛋白（LRP）是1993年由Scheper等[13]在1株无p-gp表达的对多种药物耐药的非小细胞肺癌细胞系SW-1573中最先发现的与多药耐药有关的蛋白称LRP。LRP基因定位于16号染色体，LRP的cDNA全长2688bp,编码896个氨基酸，分子量为110kD，主要位于胞浆，呈粗颗粒状或囊泡状.分析cDNA序列,意外发现LRP基因与粘菌和褐鼠的穹隆体蛋白（major vault protein,MVP）的编码基因高度同源.由此,确立了LRP既是人的MVP.MVP有完全对称的上下两部分对扣在一起组成,外观呈桶状，MVP是核孔复合物的组成部分。Izquierdo等［14］用免疫组化方法研究发现LRP在正常组织和肿瘤细胞中广泛分布。其介导耐药非常广泛，包括一些p-gp和MRP不能介导的药物的耐药，如铂类、烷化剂等［15］。MVP可通过两种途径引起MDR:一是封锁核孔,使药物不能进入细胞核,二是使进入细胞内的药物转运至胞质中的运输囊泡,呈房室分布,最终经胞吐机制排出.LRP不像p-gp耐药细胞株，对于LRP及MRP过度表达的细胞株，用CsA或其衍生物（PSC833）并不能恢复细胞内药物的积累及逆转耐药。LRP过度表达对判断治疗和预后的作用有不同的结论。Pirker等［16］用LRP单抗LRP-56检测了初诊AML患者细胞中 LRP表达与预后的关系。结果是：LRP表达率占36％，并和外周白细胞计数相关（p=0.001），诱导化疗率CR72％。在LRP阴性组CR率占81％、LRP阳性组仅有55％的CR率。LRP阳性组总生存期（OS）8个月、无病生存期（DFS）6个月。LRP阴性组OS19个月、DFS9个月。因而LRP在AML高表达提示预后不良，LRP基因是与MDR相关的耐药基因。相反，另有一些报道并不能得出在AML或MDS中LRP过度表达与预后的关系［17］。
1．4 BCRP
1998年Doyle等［18］等用RNA指纹分析（RNA fingerprinting）研究比较乳腺癌耐药细胞MCF-7／AdrVP和亲代细胞MCF-7的mRNA表达的差异,结果发现在MCF-7/AdrVP中有一2.4kb mRNA过度表达,其翻译一个633氨基酸残基的跨膜蛋白,即BCRP.它定位于染色体4q22.随后用全长BCRP的cDNA转染MCF－7细胞，结果同样导致对米托蒽醌（mistoxantrone,Mx）、拓扑特肯、阿霉素和柔红霉素的耐药，降低细胞内柔红霉素蓄积和滞留，在转染的克隆细胞中引起ATP依赖和罗丹明外排增加，进一步证实了BCRP能够在乳腺癌细胞中导致多药耐药。从MCF-7／AdrVP的耐药细胞mRNA构建的cDNA文库序列分析发现，它含有一个开放读框（ORF），编码一个633氨基酸的蛋白，至少与50个ATP结合盒(adenosine triphosphate –binding cassette,ABC)膜转运蛋白具有同源性，尤其是与果蝇W基因同源的人PIR即GO2068蛋白，它含有638个氨基酸，同源性达29.3%.BCRP结构的最主要特点是只有一个ATP结合结构域和一个疏水性的跨膜结构域,这与典型的ABC转运蛋白明显不同,后者往往由两个同源部分组成,每个部分含有一个ATP结合结构域和一个疏水性的跨膜结构域.因此,称BCRP为半转运蛋白,推测可能本身或与其它转运分子形成二聚体或多聚体而发挥作用[19 ].在人类正常组织,BCRP的表达明显不同于p-gp和MRP的表达.胎盘和中脑的特定部位豆状核BCRP mRNA水平表达最高,而在肝、小肠和大肠等处BCRP mRNA低表达,在心、肺、平滑肌、肾、胰腺、胸腺及外周血白细胞中难以测到。由于后者的原因，肿瘤组织中BCRP表达可能成为有效的肿瘤标志。Rocchi等［20］用Western blot和免疫化学染色法证实BCRP／MXR在许多耐药细胞株上表达，并且被定位于血浆侧生物膜，而不同其它共知的“半转运式”转运蛋白通常定位于细胞内生物膜上。1999年，Ross和Hazlehurst等[21，22]利用Northern和Southern印迹方法研究不同来源的肿瘤MDR细胞系，进行BCRP基因表达水平测定，结果发现，在乳腺癌MCF-7／Mitox、胃癌EPG85-257RNDV、结肠癌SM1-3.2、纤维肉瘤EPF86-079RNDV和多发性骨髓瘤8226／MR20等耐药细胞中均由BCRP过度表达，同时发现BCRP高表达与P-gp/MRP表达无关。最新研究表明,大约30％的AML细胞中mRNA BCRP相对高表达[23].Sargent等[24]在AML患者中,首次测得BCRP蛋白,并且发现BCRP的表达与p-gp无关,表明在p-gp表达阴性的耐药细胞中,部分是由BCRP引起的.Rabindran等［25］从微生物库中筛选出一个霉菌毒素(fumitremorgin C,FTC),能够逆转由BCRP介导的对阿霉素、Mx和拓扑特肯（TPT）的耐药，而对P-gp和MRP介导的耐药却无逆转作用，其机制也是增加细胞内药物蓄积。因此FTC是一潜在的并具有高度特异性的BCRP逆转剂，值得进一步研究开发并应用于临床。
2．谷胱甘肽S转移酶（GSTs）和谷胱甘肽
GSTs是一组与机体解毒作用有关的酶类，根据其在细胞内定位的不同，一般可分为α、μ、π、θ及膜结合微粒体5种类型［26］ 。GST-π又称酸性同工酶，是从胎盘中分离出来的一种酸性GST，其基因定位于11号染色体的q13位置。有7个外显子和6个内含子，全长3kb。它与恶性肿瘤关系最密切，约占其总数的90％，主要分布于消化道、泌尿系统和呼吸道上皮。Brotherick[27]等在原发性乳腺癌的研究中发现，GST-π在进展期乳腺癌或转移性乳腺癌表达显著升高,Yokoyama[28]等也发现GST-π表达与子宫内膜癌淋巴结转移存在显著的相关性。Sargent 等［29］研究38例AML病人中，GST呈现高表达。GSH是一种含半胱氨酸的三肽，为细胞内主要的非蛋白巯基。GSTs能够催化机体内亲电性化合物与GSH结合，使有毒化合物增加水溶性、减少毒性，最终排出细胞外。这种结合还可防止有毒化合物与细胞的大分子物质（如DNA、RNA和蛋白质）结合。正常情况下可作为一种保护机制使细胞免受损害，而肿瘤细胞可以通过调节GSH水平、增加GST活性等加速化学药物的代谢［30］。
3．拓扑异构酶（Topoisomerase,TOPO）
DNA Topo是在DNA复制、转录和染色体分离中起重要作用的核酶。Topo有两种类型即Topo I和 Topo II。其中Topo II作用DNA的效能大于Topo I。Topo II是真核细胞生存必不可少的。Topo II有α、β两种同工酶，分子量分别为170kD和180kD，分别定位于17号染色体和13号染色体。临床化疗中使用的许多抗癌药物正是通过干扰DNA的正常代谢而发挥抗肿瘤作用的。Topo II介导的MDR机理，目前认为与药物-酶-DNA三元复合物形成减少，药物失去药靶有关。其生化基础在于Topo II数量或性质上的改变。Topo II数量减少，引起药物作用靶分子减少，导致药物诱导DNA断裂减少和药物细胞毒作用降低；Topo II性质改变，导致DNA-Topo II结合的减少。在一些恶性肿瘤，如肺癌、宫颈癌、结肠组织中可根据其表达程度不同区分非肿瘤性病变、腺瘤及癌［31，32］。
4．蛋白激酶C（PKC）
PKC是一组Ca2+/磷脂依赖的同工酶，由两个不同的功能部位组成，即与磷脂、甘油二酯和佛波酯疏水性结合的疏水性调节部位，以及含有ATP的底物蛋白结合区域，后者是亲水性催化部位。调节部位可以通过关闭催化中心来灭活PKC。Ca2+、磷脂和佛波酯与调节部位结合导致构象改变，使PKC激活。PKC有12种类型，各亚型具有不同的组织表达和特定的细胞定位，其中，PKCα和PKCθ与肿瘤多药耐药的关系最为密切。PKC在机体细胞增值、分化和凋亡信号传导调控方面发挥重要作用，同时在肿瘤发生、发展及对抗瘤因子的反应方面也扮演着重要角色［33］。钙拮抗剂、钙调素抑制剂逆转肿瘤细胞多药耐药性的事实，使人们得以推测抗性可能涉及PKC及其受体。PKC参与蛋白质的磷酸化过程，而p-gp是一种磷酸化蛋白，MDR细胞中PKC活性增高，说明两者存在一定的联系。另外，最新资料表明，PKC介导的多药耐药可能与MDR1基因的转录激活有关，而与p-gp的磷酸化无关。Parminder 等［34］在研究乳腺癌耐药细胞系MCF-7时发现，PKCα能通过使MDR1基因的启动子磷酸化而增加其转录，且这种活动能够被PKC的激活剂阿特谱（TPA）所诱导，而被PKC的阻滞剂GF 109203X所消弱。并且，把转染的反义PKCα注入到细胞中，能够逆转MDR表型［35］。这提示我们在临床上可通过抑制PKCα的表达来减弱肿瘤的抗药性。
5．细胞凋亡与耐药
细胞凋亡是细胞在各种死亡信号刺激后发生的一系列瀑布式激活的主动死亡过程，而细胞凋亡的启动和传导需要多种基因及其产物的参与，在20世纪80年代发现了3个细胞凋亡调节基因，即p53、bcl-2和c-myc。近年来研究显示，半胱氨酸蛋白水解酶在细胞凋亡的发生中起重要作用。（1）p-53基因：p-53是肿瘤中最易发生突变的抑癌基因，野生型p-53蛋白是细胞内的“分子***”，其主要功能是细胞G1阻滞和诱导细胞凋亡，当细胞受到Vp-16、顺铂、MMC等药物或放疗作用后，细胞DNA损伤，受损细胞启动供给失调毛细血管扩张突变基因（ATM)使p-53表达增加，引起细胞G1阻滞以完成修复或进入凋亡以清除肿瘤细胞，这是化疗诱导细胞凋亡的最常见机制。但人类肿瘤一半以上可发生p-53的突变。当发生却失、突变等导致表达异常（突变型）时，对凋亡过程调控异常，可抑制化疗药物诱导的凋亡，导致耐药，同时也可特异性激活MRP-1／P-gp，产生MDR。已表明,野生型P53是不同类型凋亡的介质,这包括由化疗药物阿霉素、足叶乙甙和5-氟尿嘧啶所诱导的凋亡;有趣的是,体内和体外试验已表明P53的突变或缺失与细胞对相同化疗药物的抗性有关[36].（2）Bcl-2基因家族：近年来研究发现［37］，bcl-2基因家族参与了MDR的形成。bcl-2基因家族是细胞凋亡（apoptosis）的重要调控基因，在细胞凋亡的过程中处于调控机制的终末部分，该基因家族在维持细胞生理分化、发育和细胞数量的动态平衡中具有重要作用，它们的表达状态在一定程度上影响着肿瘤的发生、发展及多药耐药性的产生。Bcl-2基因家族是目前最受重视的调控细胞凋亡的基因家族，可分两大类：抑凋亡基因包括Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、A-1、Mcl-1、Bhrfl和Bfl-1等；促凋亡基因包括Bcl-xs、Bax、Bad、Bak、Hrk、Bim和Bnip-3等。虽然家族各成员在不同组织中表达各不相同，但它们在结构上有共同之处：一是碳端有一疏水跨膜结构域（TM）决定蛋白的亚细胞定位；此外还都有1－4个BH结构域（Bcl-2同源结构域）。其中Bcl-2是抑制细胞凋亡的重要基因，是决定肿瘤预后的重要指标。Bcl-2在滤泡状淋巴瘤和白血病都有高表达.Thomas 等［38］在乳腺癌的研究中发现，在Bcl-2低表达的患者中，有较高的CR，并且治疗诱导的凋亡水平可作为判断患者预后的标志之一。但也有相反的报道，Chang等［39］对乳腺癌患者中Bcl-2的研究后认为，Bcl-2的升高与对化疗的高反应性相关。这些报道差异的原因目前还不清楚，但可能与化疗方案、Bcl-2的测量时间、用于测量Bcl-2表达的 Bcl-2 抗体及对化疗反应敏感性定义不同有关。(3) c-myc: c-myc是myc基因家族中最重要的一员，最初是从鸡病毒v-myc癌基因的同源物中分离出来的，研究显示［40］c-myc基因的过度表达与MDR具有相关性。He等[41]用mdr1核酶来逆转耐长春新碱细胞系KBv200的耐药性.结果发现,c-myc蛋白、p-gp蛋白和c-myc mRNA在KBv/5mR3中的表达显著下降.这表明,mdr1基因和c-myc基因有很密切的关系,c-myc基因很可能参与了mdr1基因的调控.c-myc基因位于常染色体8q24位置上，在正常细胞中无或低表达，c-myc基因的过度表达将改变细胞基因的调控和细胞表型，并在多药耐药细胞中表达更高。染色体的重排将激活mdr1基因，并产生多药耐药，而c-myc基因表达的下降能增强肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性。（4）半胱氨酸蛋白水解酶和耐药：天门冬氨酸半胱氨酸特异性蛋白酶家族即caspase家族，亦称ICE/CED-3家族，是一组与细胞凋亡有关的蛋白酶，也参与MDR。Topo I和Topo II可作为caspase 3和6作用底物.化疗药物引起细胞凋亡均须激活caspase. 其它参与凋亡调控的基因，如ras、Fas/Fas L、bcr/abl、c-erbB-2/neu等也与肿瘤细胞的发生相关联。
6．其它机制
二氢叶酸还原酶(DHFR)和DNA损伤修复相关酶活性增强（MGMT）；细胞膜的改变影响药物的转运和外排；细胞激素受体量和亲和力的改变;一些细胞因子(如IL-6 [42])等也与肿瘤细胞耐药的发生相关。但是，同一耐药细胞常有几种不同的机制参与耐药形成。因此肿瘤耐药基因是多因素的，肿瘤耐药表型可随诱导药物的不同，肿瘤细胞的种类、分化阶段的不同而表现出不同耐药表型，可以是以某一耐药基因表达，也可以是多种耐药基因同时表达的多种耐药表型。应当指出的是，在以上诸多耐药机制中能在临床得到验证的很少。这是因为临床耐药与体外肿瘤细胞耐药表型和性质相差很大。
目前逆转MDR的相关策略:
1. 耐药逆转剂的应用:逆转剂是指全部或部分恢复耐药的肿瘤细胞对化疗药敏性的一类物质,根据其作用机制不同分为以下几种类型.
1.1 针对p-gp的逆转剂：1981年Tsuruo等用维拉帕米（VRP）在无毒剂量下，通过抑制药物的外排而增加药物的细胞内积累，逆转了P388耐药细胞株的耐药性，增强了长春碱的细胞毒作用，揭开了逆转MDR的新领域。随后，陆续发现了许多对p-gp介导的MDR具有逆转作用的物质。一般包括以下几类：①钙通道阻滞剂（calcium channel blocker,CCB）：钙拮抗剂是最早发现的具有逆转MDR作用的药物。主要有维拉帕米及其衍生物；双氢吡啶类化合物及硫氮卓酮等。本类药物逆转MDR作用与钙拮抗活性无关，而是因为竞争性的与p-gp结合，通过充当MDR细胞外排泵的竞争性底物以增加细胞内的药物的积聚量来实现逆转作用［43］.亦有认为钙拮抗剂在mdr-1基因的翻译水平抑制p-gp的合成及活性从而逆转MDR［44］。本类药物由于严重的心血管系统毒性，而妨碍其临床应用。故目前主要研制有钙拮抗活性，并具有很强MDR逆转作用的异构体。②钙调蛋白（CAM）抑制剂：改变膜电位，使耐药细胞膜电位恢复至敏感细胞水平，从而恢复其敏感性。如钙调蛋白拮抗剂三氟拉嗪的作用。③环孢菌素类：环孢菌素类药物是一种高度亲脂性物质，可与抗肿瘤药物竞争p-gp上的结合位点，从而抑制跨膜泵作用，使细胞内药物累积增加，逆转MDR。其代表药物为环孢菌素A及其衍生物SDZPSC833［45］。SDZPSC833逆转MDR作用比环孢菌素A强520倍，且无环孢菌素A的免疫抑制及肾毒作用。抑制p-gp外排泵作用持续时间明显长于维拉帕米，且体内可达有效逆转浓度。另有报道SDZPSC833对化疗药物的药代动力学有影响，可增加足叶乙甙的血药水平，减缓其从体内排泄。④亲脂性化合物；⑤激素及抗激素类化合物：在此类药物中，对雌激素部分拮抗药三苯氧胺（TAM）及抗孕激素药RU486研究较多［46，47］。三苯氧胺在体外、体内均表现出较强的逆转MDR作用，现已作为MDR逆转剂用于临床。孕酮、甲地孕酮及抗孕酮化合物RU486，均可不同程度地抑制p-gp功能，其中，RU486的逆转作用比孕酮强2倍。此外，分子结构中第11位含羟基的类固醇激素，已表明是p-gp的转运底物，可见类固醇激素衍生物也是一类可以抑制p-gp泵出功能的逆转剂［47］。⑥喹啉类；⑦PSC-833［48］、PAK-104P[49]和MS-209［50］等。
1．2针对MRP的逆转剂：MRP是谷胱甘肽-S-共轭物转运泵，转运共轭的阴离子，如半胱氨酰LTC4、谷胱甘肽-S-共轭物、黄曲霉素B1、葡萄糖醛酸共轭物、锑和砷的氧化阴离子等。与p-gp不同，它不能直接转运其介导耐药的未修饰的药物，而需要谷胱甘肽的参与。近年来研究发现喹啉类、抗激素类（如抗孕激素RU486）、非甾体抗炎药（NASID）、SN-38［51］、GST耗竭剂都能逆转MRP介导的MDR［52］。
1．3针对肺耐药蛋白的逆转剂：针对LRP目前尚未发现有效的、特异性逆转剂。仅有报道在白血病患者中，PSC可以纠正LRP因LRP表达引起的肿瘤细胞内柔红霉素蓄积量。
1．4针对谷胱甘肽和GST的逆转剂：目前抑制GSH的药物有丁硫氨酸亚砜胺（buthionine sulfoximine ,BSO）、硝基咪唑类、VitK3、扑热息痛、硒酸钠、硒半胱氨酸、GS-EA等［53］。BSO是一种人工合成的氨基酸，它是GSH合成限速酶－γ谷氨酰-半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase）的强效抑制剂，能有效地阻断GSH的合成，从而降低细胞内GSH水平，并增加肿瘤细胞对MEL、DDP和MMC的敏感性。逆转GST的药物主要是利尿酸，其可逆转烷化剂的耐药，且有实验证实与BSO联用时逆转作用更大。此外，还有依他尼酸(ethacrynic acid)等。
1．5针对蛋白激酶C的逆转剂：根据作用于PKC的部位，其抑制剂可分为3类：①作用于催化区；②作用于调节区；③对以上两区均有作用。目前已证实的逆转剂有Staurosporine及其衍生物NA-382、CGP41251;此外还有K-252a、calphostinC、H-7等药物。
1．6针对凋亡调控基因的逆转：①加入促凋亡物质如全反式维甲酸等可降低耐药细胞BCL-2、BCL-XL等基因的表达。②植入促凋亡基因，如野生型p-53基因等。近年来有关p-53基因替换疗法研究很多，有些已进入临床试验阶段。Riva[54]将脂质体介导的野生型p-53转染到肺癌细胞系H358和Calu-1，发现两种细胞对顺铂的敏感性分别增加了14和1.2倍，并能使之保持3周。Osaki［55］将腺病毒介导的野生型p-53转染到肺磷癌细胞系NCI-H157和大细胞癌细胞系NCI-H1299之后，再分别联合应用12种化疗药观察，发现野生型p-53转染后对一些药物如5-FU、顺铂和博莱霉素等能起到协同作用或相加作用。临床试验中Nemunaitis等［56］对24例NSCLC晚期并有异常p53的患者应用瘤内注射腺病毒介导p53（Adp53）联合CDPP治疗，观察到Adp53最大计量可达1×1011pfu，其中17例取得了很好的效果，为临床应用p53基因以逆转耐药积累了第一手资料。
1.7联合应用机制不同的逆转剂：具有数种耐药机制参与MDR，只对一种机制作用很难奏效，合用有协同作用的逆转剂，可减少剂量，降低毒性。
2．给药载体介导系统在耐药逆转中的应用
逆转剂的应用无疑是解决MDR的一种常用方法，但往往因为逆转剂的毒性较强，副作用较大而影响其在临床上的广泛引用。因此，借助某些给药介导载体，减少药物用量，实现药物的靶向给药将是颇有意义的新途径。包括：①多肽、蛋白类介导载体；②脂质体（liposome）介导；③豪微粒(nanoparticles,NP)介导。
3.MDR的反义基因治疗
研究表明,肿瘤细胞产生MDR的根本原因是某些基因不协调表达,导致某些与MDR相关的蛋白质和酶上调或下降,因此在基因水平逆转MDR将是解决问题的关键.目前此方面主要是MDR1基因及某些癌相关基因的研究.肿瘤的反义基因治疗就是通过碱基配对特异性地与某些DNA或RNA结合,在转录和翻译水平阻断某些异常基因的表达,以期阻断肿瘤细胞内的异常信号传导,使肿瘤细胞进入正常分化轨道或引起细胞凋亡.包括反义寡核苷酸技术(ASODN)、核酶(ribozyme)技术和反义RNA技术。这些反义核酸技术给耐药逆转提供了新的高效率、高特异性的方法，较传统的MDR逆转方法有较多优势。
3．1反义寡核苷酸技术：ASONs就是用一段人工合成的能与RNA或DNA互补结合的寡核苷酸链来抑制基因的表达，其作用原理是：①ASONs与DNA结合，抑制DNA复制和转录；②ASONs与mRNA前体结合，阻断RNA加工、成熟，影响核糖体沿mRNA移动；③激活RNase,剪切杂交链中未配对的碱基。最近有学者[57]用MRP和bcl-2反义寡核苷酸共转染耐顺铂肺腺癌细胞株（A549／DDP），使该细胞对顺铂敏感性增加4.8－7.2倍。同时对VP-16和表阿霉素敏感性也同步增加。杂合子丢失（Loss of heterozygosity,LOH）可引起必需基因的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms,SNPs）,抑瘤基因P53附近的核糖核酸聚合酶II（POLR2A）基因经常在肿瘤细胞显示杂合性丢失.Kees Fluiter等［58］的报道显示，直接作用于POLR2A的反义寡核苷酸能抑制体内肿瘤细胞生长，并且一个碱基的错配就能有效地抑制肿瘤生长的特定等位基因。
3.2反义RNA技术：反义RNA技术指利用基因重组技术，构建人工表达载体，使其体外或体内表达反义RNA，从而抑制靶基因的表达。其作用原理有：①与前mRNA结合，影响mRNA的成熟和在胞浆内转运；②与相应的靶RNA结合从而激活RNase,加速靶RNA的降解；③直接与起始密码子AUG结合而阻止转录的启动；④互补作用于SD编码区的反义RNA可阻止核糖体在mRNA上的移动。Gao等［59］分别把携有MDR1、MRP反义RNA的逆转录病毒导入阿霉素选择出的人NSCLC细胞株GAOK，细胞对阿霉素、长春花碱、秋水仙碱的耐药程度减少40％-50%，而共转染MDR1和MRP反义RNA后发现，p-gp、MRP的表达分别减少64％和93％，对上述化疗耐药程度减少97％左右。实验提示p-gp、MRP在GAOK细胞株耐药过程中共同起作用，共转染两者的反义RNA可协同逆转耐药。
3．3核酶技术：核酶是一类具有酶活性的RNA分子，由Cech等首次发现，它能特异性地识别mRNA中的GUC序列，并催化RNA的剪接和剪切反应，这种作用无需能量就能使RNA被降解，使之无法进行转录和翻译，而且催化效率很高，一分子核酶可切割多分子的靶RNA，自身不被消耗可重复使用。核酶的基因组成分两部分：中间的极为保守的核苷酸序列（活性中心）和两端的引导序列。引导序列与靶RNA互补结合时，中间保守序列即在该特定位点切断，从而具有高度特异性。另外，核酶不编码蛋白质，无免疫原性。由于其高效率、高特异性、少副作用的特点，核酶在基因治疗中倍受青睐，被誉为“分子剪刀”和“分子外科”，在抗HIV、抗病毒和治疗白血病及肿瘤方面得到了广泛的应用[60,61]。Chen等［62］用mdr1核酶导入A549／R对mdr1 mRNA进行剪切，观察到mdr1 mRNA减少，p-gp表达下降，罗丹明聚集增加，细胞对阿霉素敏感性增加200倍。GAO 等[63]用逆转录病毒介导的MDR1核酶来抑制p-gp在耐药的肿瘤细胞系GAOK／DOX的表达。由于185的密码子对MDR1mRNA的激活较重要，所以选择了该密码子附近的196位的GUC来设计MDR1mRNA。结果表明，MDR1核酶能够有效阻断MDR1基因的转录并且阻止p-gp的合成。Kobayashi用MDR1核酶来逆转急性淋巴细胞白血病细胞的耐药性，结果药物敏感性增加了700倍［64］。另外，HIV核酶可成功地阻止抗原蛋白P24的合成；Ras核酶可逆转人膀胱癌耐药细胞的表型。值得指出的是，逆转录病毒由于其可产生高效价病毒，具有高感染效率，可感染许多种细胞，且对宿主细胞无害而在基因逆转方面具有潜在优势。目前，反义核酸药物的开发也是最有前景的项目之一，但事实上仍有许多问题亟待解决：①寡聚物易被降解（经过化学修饰的类似物也可在体内缓慢清除）；②细胞摄取的效率有待提高；③寡聚物的非特异结合降低了其效率；④对mRNA的非特异阻断（可能由于寡聚物同DNA序列能形成部分或暂时的碱基配对）。
4．细胞因子基因：Stein等研究发现一些细胞因子如TNF、IFN和IL-2可降低MDR1基因mRNA和p-gp的表达水平，增加细胞对药物的敏感性。但细胞因子静脉应用副作用极大，因此他们将细胞因子基因转入肿瘤细胞，结果显示可明显降低MDR1 mRNA 和p-gp的表达水平，使细胞内药物浓度提高。AKI等[65]在研究肝细胞癌细胞系（HepG2,HuH7，SK-Hep-1）时发现,IFN-α和顺铂（CDDP）联用时，可降低MDR1、MRP、TOPO IIα和TOPO IIβ基因在HepG2中的表达；降低MDR1和GST-π基因在SK-Hep-1中的表达,从而可增加耐药细胞系对顺铂（CDDP）的敏感性。这提示我们，联合应用CDDP和IFN-α来治疗进展期肝癌可能具有一定的临床价值。
5．间接对抗MDR的基因治疗：将一些耐药基因（如MDR1、MRP等）转移至造血干细胞［66］，以降低化疗药物对骨髓的毒性，这样就可能用高剂量的药物杀伤肿瘤细胞而不破坏骨髓细胞，间接解决耐药的问题。体外实验表明,将MDR1基因转移至小鼠的正常骨髓细胞,可提高化疗剂量而不增加骨髓毒性[67,68].根据前临床研究结果，荷兰学者提出将MDR1基因转移至大计量化疗后无法治愈的肿瘤患者的造血干细胞开展临床I期的研究。通过临床I期研究主要想解决几个问题：①MDR1基因转移至骨髓造血细胞后是否可使CD34＋细胞MDR表达增加；②回输转染MDR1的细胞后是否可使造血重建；③是否具有长期重建造血的功能；④对于化疗引起的骨髓抑制是否具有保护作用。如果I期临床试验能获得令人满意的结果，这个方案将进入II期试验，即加大化疗计量，观察对骨髓的保护效应。除MDR基因外，二氢叶酸还原酶（mDHFR）、MGMT、GST及醛脱氢酶（ALDH）等也被用于肿瘤耐药基因的研究。
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