睡眠片段化对高脂喂养小鼠心脏重塑的作用研究
睡眠片段化（sleep fragmentation, SF）指夜间睡眠中存在多次简短的唤醒状态［1］，是睡眠障碍的标志之一，严重影响睡眠质量。睡眠片段化常见于老年人、更年期妇女、阻塞性睡眠呼吸暂停、阿尔茨海默病中，其与心血管疾病、代谢疾病及免疫系统密切相关［2-4］，严重影响人们的生活质量。本课题组前期对大型人群队列进行研究，发现睡眠障碍与心脏重塑显著相关［5］，且受到脂代谢相关基因的调控，但具体的作用机制尚不清楚。代谢性疾病包括糖尿病、高脂血症、肥胖和非酒精性脂肪性肝病等，已成为全球性公共卫生问题，其患病率呈显著上升趋势［6］。既往研究提示高脂饮食是代谢性疾病发生的重要危险因素［7］，高脂饮食可使血脂升高，引发机体代谢紊乱，促进心肌细胞及细胞外基质不良重塑，最终导致心肌梗死、心力衰竭等不良心血管结局［8］。目前，多种不健康生活方式对心血管系统影响的叠加作用日益受到临床重视。虽然文献报道睡眠片段化可对心血管疾病发挥直接影响，但对于睡眠片段化在高脂饮食患者中诱导心脏重塑的作用机制研究较少。本研究拟通过建立相应的动物模型，从生物分子层面出发，结合转录组学与代谢组学的研究方法，探讨睡眠片段化引起高脂喂养小鼠心脏重塑的关键靶点及作用机制，为揭示睡眠片段化和高脂饮食等不健康的生活方式对心血管疾病影响的机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 研究时间
2023年8月—2024年6月。
1.1.2 实验动物
21只8周龄雄性C57BL/6J小鼠，体质量20~22 g，购自北京大学医学部实验动物科学部。将21只小鼠随机分为睡眠片段化组（SF组，n=11）与对照组（Ctrl组，n=10），分别放置于睡眠剥夺仪和普通笼位中，两组均给予45%高脂饲料喂养。饲养室室温为（24±2）℃，相对湿度为（60±10）%；小鼠可以自由摄食和饮水，12 h明/暗交替。SF组中的睡眠剥夺杆参数设置为10转/min，每次剥夺时正向与逆向各转1圈，距下一次剥夺时间间隔2 min，剥夺时间为每日7：00~19：00，与饲养室人工光照时间一致。睡眠片段化干预时间为5个月。本研究经北京大学第一医院实验动物伦理委员会批准（动物实验伦理批准号为：J2021104）。
1.1.3 实验仪器设备
睡眠剥夺仪（XR-XS 108型，上海欣软信息科技有限公司），45%高脂饲料（H10045，北京华阜康生物科技股份有限公司），伊红染液（G1002-100ML，武汉赛维尔生物科技有限公司），Masson三色染色液（G1006-20ML，武汉赛维尔生物科技有限公司），普通小麦胚芽凝集素（WGA, L4895-2MG, Sigma），Trizol试剂（Thermo Fisher Scientific, 15596018），小动物超光声多模态成像系统（VisualSonics 2100）。
1.2 实验方法
1.2.1 超声心动图检查
睡眠片段化干预5个月后对小鼠进行超声心动图检测，获得超声心动图后测定左心室舒张期内径（left ventricular internal dimension diastole, LVIDd）、左心室收缩期内径（left ventricular internal dimension in systole, LVIDs）、左心室舒张末期容积（left ventricular end-diastolic volume, LVEDV）、左心室收缩末期容积（left ventricular end-systolic volumes, LVESV）、舒张期左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness diastolic, LVPWd）、收缩期左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness systolic, LVPWs）、舒张期左心室前壁厚度（left ventricular anterior wall thickness diastolic, LVAWd）、收缩期左心室前壁厚度（left ventricular anterior wall thickness systolic, LVAWs）等指标。
1.2.2 心脏质量测定及取材
心脏超声检测后处死小鼠，0.9%氯化钠溶液从心尖进行全身灌注后取出心脏，清洗干净心腔血液并用纱布吸干水分，称取心脏质量，以心脏质量/体质量（HW/BW）和心脏质量/胫骨长度（HW/TL）代表心脏质量指数。取靠近心底侧2/3心肌组织进行固定、包埋、切片，用于后续染色；将剩余心肌组织进行液氮速冻，-80 ℃冻存，用于转录组学及代谢组学检测。
1.2.3 心肌HE染色及Masson染色
取出心肌石蜡切片进行HE染色和Masson染色，显微镜下观察染色情况。Masson染色下胶原呈蓝色，每个样本随机选择9个视野，运用Image J软件计算心肌中胶原含量。
1.2.4 WGA染色
将心肌组织石蜡切片脱蜡至水，按照普通WGA染色试剂说明对切片进行染色，最终使用荧光显微镜进行观察。每个小鼠心肌样本随机选择3个视野，每个视野运用Image J软件随机选择30个细胞统计心肌细胞面积，计算每个样本心肌细胞大小均值。
1.2.5 RNA-seq测序分析
每组随机选择3只小鼠心肌组织提取RNA，送至上海嘉因公司进行转录组学测序。根据|log2FC|≥1且P<0.05作为标准，筛选出Ctrl组与SF组的差异基因。以小鼠全基因组为背景，P<0.05为标准进行GO与KEGG富集分析。
1.2.6 代谢组学分析
每组随机选择6只小鼠心肌组织提取代谢物，使用液相色谱-质谱联用技术检测代谢物（中科脂典），并与代谢物数据库（AB Sciex, Concord, ON, Canada）、HMDB、METLIN数据库进行比较，以注释离子信息。差异代谢物的筛选标准为VIP≥1，且P<0.05。
1.2.7 转录组与代谢组联合分析
采用Pearson相关性分析对差异表达基因与差异代谢物进行联合分析，相关性系数阈值≥0.8，且P<0.05。
1.3 统计学方法
采用SPSS 26.0和GraphPad Prism 10.0软件进行统计分析。计量资料均符合正态分布，以（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组小鼠体质量与心脏质量比较
第0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20周时，两组体质量比较，差异均无统计学意义（t=-0.86、1.15、1.56、1.26、0.92、0.92、1.19、-0.20、0.54、0.03、0.49，P>0.05）。与Ctrl组相比，SF组心脏质量（t=-2.11，P<0.05）、HW/TL（t=-2.30，P<0.05）、HW/BW（t=-2.87，P<0.01）均增加，差异有统计学意义。
2.2 两组小鼠心脏超声结果比较
与Ctrl组相比，SF组LVIDd值（t=-3.50，P<0.01）、LVIDs值（t=-2.64，P<0.05）、LVEDV值（t=-3.42，P<0.01）、LVESV值（t=-2.56，P<0.05）均增加，差异有统计学意义，提示SF组心腔显著增大。与Ctrl组相比，SF组LVPWd值减少（t=2.84，P<0.05），差异有统计学意义，提示SF组左心室后壁厚度显著变薄。两组LVPWs、LVAWd、LVAWs比较，差异无统计学意义（t=0.93，t=0.85，t=-1.13，P>0.05）。
2.3 两组小鼠心脏病理变化比较
HE染色显示，与Ctrl组相比，SF组心脏增大，心肌细胞增大；Masson染色统计图显示，与Ctrl组相比，SF组心肌纤维化增多，差异有统计学意义（t=-4.07，P<0.01）；WGA染色统计图显示，与Ctrl组相比，SF组心肌细胞变大，差异有统计学意义（t=-4.83，P<0.001）。
2.4 两组差异表达基因火山图及热图
与Ctrl组相比，SF组有118个基因表达存在差异，其中54个基因显著上调，64个基因显著下调。显著的差异基因有NOXO1、NOX4、Nr4a3等。
2.5 两组差异表达基因的GO与KEGG富集分析
GO分类统计显示差异表达基因显著富集的功能包括：免疫系统过程的调节，细胞活化，纤连蛋白结合等。KEGG富集分析结果显示，差异表达基因富集的通路为T细胞受体信号通路，细胞外基质（ECM）受体相互作用，黏着斑等。
2.6 两组心脏重塑相关GSEA图
与Ctrl组相比，SF组胶原纤维组织与ECM出现明显上调，转化生长因子β（TGF-β）信号通路明显上调。
2.7 两组代谢物分析与差异代谢物筛选
代谢组学共检测到羧酸及其衍生物、脂肪酰基、甘油磷脂等42类代谢物，主成分分析中的碎石图显示主成分1（Dim-1：22.5%）和主成分2（Dim-2：18.9%）能解释接近41%的样品间整体方差，两组样品没有明显的离群值，并且在前两个主成分上有一定的区别。其中Tyrosylhydroxyproline显著上调。LysoPC（22:4）、 sn1 LysoPC（16:0e）、sn1 LysoPC（14:0）等物质显著下调。差异代谢物通路富集显示主要通路包括甘油磷脂代谢，初级胆汁酸生物合成，谷胱甘肽代谢等。
2.8 转录组学与代谢组学联合分析
转录组学与代谢组学联合分析结果表明，两组差异表达基因与差异代谢物在甘油磷脂合成途径存在显著的相关性。与Ctrl组相比，SF组Col8a2、Comp、NOX4等差异基因显著升高，与各种溶血磷脂酰胆碱及溶血磷脂酰乙醇胺含量的下降密切相关。
3 讨论
睡眠片段化及高脂饮食等不良生活习惯与心脏重塑的发生及演变密切相关，临床研究证明夜间睡眠片段化程度与心血管疾病及全因死亡率显著相关［9］，而高脂饮食是重要的心血管风险因素［10］。目前，人群多种不良生活习惯并存。为了探究高脂饮食人群中的睡眠片段化问题，本研究使用睡眠剥夺仪每次间隔2 min将高脂小鼠从睡眠中唤醒，该模型拟模仿中度至重度阻塞性睡眠呼吸暂停患者所经历的觉醒频率［11］，其已被大量研究证明可以稳定的造成小鼠睡眠片段化，不会引发小鼠的应激行为［12］。本研究结果表明，与单纯高脂饮食的对照组小鼠相比，睡眠片段化干预后高脂饮食小鼠心脏质量明显增加，心脏质量/体质量和心脏质量/胫骨长度显著升高；心脏彩超结果显示LVIDd、LVIDs、LVEDV、LVESV明显增加，LVPWd显著减少，提示睡眠片段化后小鼠出现心腔增大，室壁变薄；病理染色提示睡眠片段化组小鼠心肌细胞增大，心肌纤维化增多，心脏重塑更为显著，与既往研究结果相似［13-14］。为了进一步探究睡眠片段化导致高脂饮食小鼠心脏重塑的机制，本研究分别使用转录组学和代谢组学方法从转录水平与代谢水平进行了初步探讨。
睡眠质量密切影响着心血管疾病的发生发展，其引起心血管疾病的机制包括炎症作用、氧化应激等途径。文献报道睡眠质量下降会导致小鼠出现中性粒细胞积累和细胞因子风暴样综合征，引起严重的炎症风暴［15］。本研究转录组学结果提示，在进行睡眠片段化干预后，大量差异表达基因富集在免疫系统的调节、T细胞受体信号通路等免疫相关通路上，证实炎症反应与心脏重塑关系密切。火山图结果提示睡眠片段化引起高脂小鼠心脏重塑的差异基因有NOX4、NOXO1、Nr4a3等，均在睡眠片段化组中出现显著升高。NOX4为NADPH氧化酶4，其可调控超氧阴离子的生成，通过氧化应激途径诱导心脏重塑［16］。NOXO1是NADPH氧化酶1，会导致细胞内活性氧（ROS）水平增加，进而引发氧化应激［17］。Nr4a3也同样与线粒体氧化应激通路相关［18］。Bose等［13］研究表明睡眠片段化通过靶向氧化还原途径导致小鼠心脏线粒体损伤，肌节紊乱和凋亡，而给予抗氧化剂喂养后，可有效改善睡眠片段化引起的线粒体功能障碍与心功能障碍，表明睡眠片段化后，氧化应激途径增强会促进小鼠心脏重塑的形成。
心脏代谢组学的结果提示甘油磷脂代谢变化最为显著，LysoPC（22:4）、sn1Lyso PC（16:0e）、sn1LysoPC（14:0）等溶血磷脂酰胆碱差异显著，在睡眠片段化组出现明显下降。磷脂酰胆碱是磷脂的主要成分，在维持细胞膜稳定，保证细胞正常功能中发挥着极其重要的作用［19］。Zhu等［20］研究发现LysoPC（C18:2）、LysoPC（C16:0）、LysoPC（C18:1）在心肌梗死患者中显著降低。另一项大型队列研究也证实溶血磷脂酰胆碱在心血管疾病发生时显著下降［21］。本研究提示，在进行睡眠片段化干预后，小鼠心肌组织中溶血磷脂酰胆碱出现显著降低，提示其可能是心脏重塑后的代谢物指标，并用于监测心脏重塑的发生，为干预治疗提供全新的代谢靶点。
转录组学与代谢组学联合分析结果表明，Col8a2、Comp、NOX4等差异表达基因与甘油磷脂代谢呈负相关。Col8a2编码Ⅷ型胶原蛋白，是细胞外基质的重要组成成分，高Col8a2水平预示着各种心脏病患者的心脏重塑和不良预后［22］。Comp为心脏重塑的潜在标志物［23］。NOX4通过调节线粒体能量代谢，促进氧化应激等方式参与心脏重塑的不良结局中。联合分析结果表明Col8a2、Comp、NOX4等差异基因的高表达与甘油磷脂代谢产物降低具有密切的相关性，但其与甘油磷脂代谢的具体作用机制还需要进一步探究。
综上所述，本研究发现睡眠片段化干预可显著增加高脂喂养小鼠的心脏重塑，包括：增大心肌细胞面积、增加心肌纤维化程度和增加心腔面积。基于转录组与代谢组学的进一步研究结果显示，睡眠片段化会加剧心脏重塑，与TGF-β信号通路的上调和甘油磷脂代谢途径下调显著相关，且可能受到Col8a2、Comp、NOX4等基因的调节。本研究表明在高脂饮食情况下，睡眠片段化显著影响心脏健康，增加心血管代谢疾病的发生风险，为探索睡眠片段化增加心脏重塑的机制提供了新的思路。同时该研究也提示临床应该重视睡眠片段化对于高脂饮食人群的影响，注重提升睡眠的质量。
参考文献略
