睡眠呼吸暂停所致的相关障碍性免疫损伤对雌性大鼠生殖系统的影响研究
睡眠呼吸暂停作为一种以睡眠期间呼吸道部分或完全反复阻塞为特征的疾病，发病率日益升高，成年女性患病率高达6%~19%，目前已经证实睡眠呼吸暂停可引起代谢、内分泌、生殖、肿瘤、泌尿等全身多系统损伤［1］。反复缺氧复氧除引起靶器官氧化应激、慢性炎症外，还会引起免疫损伤。有学者认为，病理睡眠模式会严重损害女性生殖健康，引起包括多囊卵巢综合征在内的多种生殖系统病变［2-4］。但检索国内外相关文献发现，现阶段有关睡眠呼吸暂停与女性生殖系统健康的因果关系尚未完全明确，且大多集中在睡眠呼吸暂停相关氧化应激、慢性炎症的研究中，对于睡眠呼吸暂停所致的相关障碍性免疫损伤是否可引起生殖毒性尚不明确，因此分析睡眠呼吸暂停所致的相关障碍性免疫损伤对雌性大鼠生殖系统的影响是进一步研究的重点。本研究初步揭示睡眠呼吸暂停所致的相关障碍性免疫损伤对雌性大鼠生殖系统的影响，以期为睡眠呼吸暂停对女性生殖系统危害的研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 研究动物
2023—2024年，购买4~6月龄的雌性SD大鼠30只，SPF级，体质量240~280 g，购自中美冠科生物技术（太仓）有限公司，动物许可证号：SYXK（苏）2024-0059。于温度（25±1）℃、湿度40%~60%环境适应性饲养1周，适应性饲养期间大鼠均自由进食、饮水，光照/黑暗环境每隔12 h替换。本研究经天津大学海河医院伦理委员会批准，审批编号：2025HHWZ（A）-002。
1.2 试剂与仪器
雌激素受体α亚型（ERα）一抗、雌激素受体β亚型（ERβ）一抗（艾美捷科技有限公司）；苏木素-伊红染液（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；Toll样受体4（TLR4）一抗、RelB一抗（武汉华美生物工程有限公司）；Transwell小室（广州威佳科技有限公司）；低氧动物舱（上海玉研科学仪器有限公司）；BX53型光学显微镜［奥林巴斯贸易（上海）有限公司］。
1.3 分组与模型制备
将30只大鼠随机分为空白对照组、短期组、长期组，各10只，短期组正常饲养3周后，在制备睡眠呼吸暂停模型基础上饲养3周。长期组在制备睡眠呼吸暂停模型基础上饲养6周。模型制备：使用低氧动物舱，实验过程中分别使用钠石灰、无水氯化钙吸收舱内二氧化碳（CO2）与水蒸气，制造缺氧环境，缺氧过程中大鼠正常饮食，自由活动。长期间歇性进行低氧实验，压缩空气与混合气体在电磁阀的控制下以2 L/min流速输入低氧舱，间隔30 s，循环1次/min，8 h/d（8：00~16：00），其余时间大鼠置于饲养笼，正常室温、湿度、空气条件下饲养。空白对照组每日对应时间置于相同规格的玻璃舱内，输入空气，不做缺氧处理，正常饲养6周。
1.4 指标观察
1.4.1 动情周期观察
模型制备完成后每日上午8：00连续2周使用0.9%氯化钠溶液浸湿的消毒棉签擦拭获取阴道上皮细胞标本，进行阴道上皮细胞涂片，使用瑞氏-吉姆萨染色，中性树脂胶封片，光学显微镜下阅片，正常大鼠完整的动情周期持续时长为4~5 d，若时长≥6 d或在某一时期长期滞留则说明动情周期紊乱。记录每组大鼠动情周期时长，观察大鼠动情周期紊乱率。
1.4.2 取材及组织处理
于模型制备完成后次日3组大鼠均使用40 mg/kg的1%戊巴比妥钠麻醉，取3 mL腹主动脉血用于树突状细胞（DCs）分离培养，而后每组处死5只大鼠，迅速剥离双侧卵巢，右侧卵巢在4%多聚甲醛中固定，用于卵泡数量观察，左侧卵巢使用PBS体积为1∶9的比例制备组织匀浆，取上清液保存在-80 ℃冰箱中，用于ERα、ERβ检测。
1.4.3 卵巢组织ERα、ERβ表达量检测
取出卵巢组织匀浆裂解后移入离心管中，低温环境下，以离心半径10 cm、20 000 r/min离心30 min获得上清液，使用蛋白印迹（Western Blotting）法检测卵巢ERα、ERβ表达量，分离蛋白后电泳、转膜、封闭，加入1∶400稀释的ERα、ERβ一抗，37 ℃下孵育4 h，加1∶2 000稀释的二抗过夜，使用显影液显影，采集图像，读取目标蛋白与内参蛋白GAPDH灰度值比，获得ERα、ERβ表达量。
1.4.4 卵巢组织中卵泡数量观察
取多聚甲醛中固定的右侧卵巢组织，水洗、乙醇梯度脱水后使用二甲苯固定，浸蜡、石蜡包埋、切片，脱蜡后进行常规苏木素-伊红染色，于显微镜下观察原始卵泡、初级卵泡、窦状卵泡、闭锁卵泡数目。
1.4.5 DCs分离培养及迁徙能力检测
取3 mL腹主动脉血，使用密度梯度离心法获得单个核细胞，经免疫磁珠阴性筛选法去除CD3、CD14、CD19、CD56细胞，并经阳性筛选法筛选CD34阳性细胞，而后继续在含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、重组白介素4的RPMI-1640培养基培养，若观察到类似DCs形态的细胞使用CD1a抗体测定纯度，比例≥90%则表示初始DCs培养成功。使用Transwell侵袭实验检测DCs迁徙能力，细胞胰酶消化后无血清培养基重悬，Transwell小室上室均加200 μL细胞悬液，下室加600 μL含血清培养基，培养24 h后使PBS洗涤、多聚甲醛固定下室，加结晶紫溶液染色，使用倒置显微镜观察DCs迁徙能力。
1.4.6 DCs刺激同种T淋巴细胞增殖反应（MLR）
使用RPMI-1640培养基洗涤DCs，1 000 r/min离心6 min，离心半径10 cm，复苏并洗涤异体非黏附细胞，细胞调整为1×106个/mL，以此作为异体T细胞，按照DCs∶T细胞=1∶5的比例接种于96孔板中，并设置混合细胞组（按DCs∶T细胞=1∶5比例共培养）、刺激细胞组（单独培养T细胞，未加DCs）、反应细胞组（单独培养DCs，无T细胞刺激），继续孵育，2 d后加入二甲基亚砜，在分光光度计上的630 nm波长处测定OD值，计算MLR，MLR=（混合细胞组OD值-刺激细胞组OD值）/反应细胞组OD值。
1.4.7 DCs内TLR4/RelB表达量检测
使用Western Blotting法测定DCs内TLR4、RelB表达量，将细胞在含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液中裂解，使用二喹啉甲酸法检测蛋白浓度，加热变性后取25 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳、转膜、封闭操作，加入TLR4、RelB抗体（1∶1 000）和内参蛋白GAPDH抗体，4 ℃孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育120 min，滴加ECL，在Bio-Rad化学发光成像系统拍照，使用Image J软件进行灰度扫描，获得TLR4、RelB表达量。
1.4.8 大鼠生育力评价
每组剩余的5只雌性大鼠与雄性大鼠合笼配种，次日检查雌性大鼠阴栓判断是否交配，若无阴栓者做阴道涂片检查是否有精子，记录大鼠交配率、妊娠率及活产率以评价生育力。
1.5 统计学方法
采用SPSS 23.0统计软件进行分析处理。计量资料采用（x±s）描述，多组间比较采用单因素方差分析，若方差齐，组间两两比较选择LSD-t检验；若方差不齐，组间两两比较选择Dunnett's t检验。计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 3组大鼠动情周期分析
正常SD大鼠一个动情周期为4~5 d，动情前期以膨大、椭圆形的有核上皮细胞为主，动情期以形态不规则的无核角化细胞为主，动情后期则以白细胞、有核上皮细胞、角化细胞常见，间期以白细胞为主。空白对照组动情周期紊乱率为0，短期组动情周期紊乱率为40%（4/10），长期组动情周期紊乱率为70%（7/10），3组动情周期紊乱率比较，差异有统计学意义（χ2=10.621，P=0.005）；其中长期组动情周期紊乱率高于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.017）。
2.2 3组大鼠卵巢组织ERα、ERβ表达量比较
3组大鼠卵巢组织ERα、ERβ表达量比较，差异有统计学意义（P<0.05）；其中短期组、长期组卵巢组织ERα、ERβ表达量低于空白对照组，长期组卵巢组织ERα、ERβ表达量低于短期组，差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.3 3组大鼠卵巢组织中卵泡数量比较
3组大鼠原始卵泡、初级卵泡、窦状卵泡、闭锁卵泡数目比较，差异有统计学意义（P<0.05）；其中短期组、长期组原始卵泡、初级卵泡、窦状卵泡数目低于空白对照组，闭锁卵泡数目高于空白对照组；长期组原始卵泡、初级卵泡、窦状卵泡数目低于短期组，闭锁卵泡数目高于短期组，差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.4 3组大鼠DCs迁徙能力、MLR能力比较
3组DCs迁徙比例、MLR比较，差异有统计学意义（P<0.05）；其中短期组、长期组DCs迁徙比例低于空白对照组，MLR高于空白对照组；长期组DCs迁徙比例低于短期组，MLR高于短期组，差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.5 3组大鼠DCs内TLR4、RelB表达量比较
3组DCs内TLR4、RelB表达量比较，差异有统计学意义（P<0.05）；其中短期组、长期组DCs内TLR4、RelB表达量高于空白对照组，长期组DCs内TLR4、RelB表达量高于短期组，差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.6 3组大鼠生育力及子代发育情况分析
3组大鼠均完成交配。3组妊娠率、活产率比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其中长期组妊娠率、活产率均低于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.017）。
进一步分析子代发育情况发现，记录活产子代小鼠出生21 d体质量变化，结果发现，21 d内，空白对照组、短期组、长期组子代小鼠体质量均随时间递增。前15 d增长平缓，三组体质量差距小；15 d后增长加速，且体质量有空白对照组>短期组>长期组的趋势。
3 讨论
睡眠是维持人体内环境稳态、维持能量代谢和调节神经内分泌功能的生理过程，健康的睡眠被认为是生命健康的重要基础，睡眠呼吸暂停是多种全身疾病的独立危险因素，如高血压、冠心病、生长发育迟缓、不孕不育、性功能障碍等［5-6］。通过对成年睡眠呼吸暂停患者进行研究发现，长期反复出现睡眠呼吸暂停所导致的间歇性缺氧、睡眠片段化等均会损伤并抑制下丘脑-垂体-性腺轴，导致内环境紊乱，影响性激素分泌，从而影响生殖系统［7］。一项基于大样本不孕女性的回顾性研究发现，睡眠呼吸暂停较常见，且是增加女性不孕的重要危险因素［8］。临床有关睡眠呼吸暂停与女性性激素关系的研究表明，伴有睡眠呼吸暂停的女性促卵泡生成素（FSH）、促黄体生成素（LH）升高，雌二醇（E2）降低，这可能因为下丘脑的视交叉上核由时钟基因调控，可节律性地刺激垂体促性腺激素细胞释放LH，导致性激素分泌紊乱。本研究发现，原有动情周期规律的雌性大鼠，在发生睡眠呼吸暂停后动情周期明显紊乱，卵巢组织中ERα、ERβ表达量均显著降低，且原始卵泡、初级卵泡、窦状卵泡数目降低，闭锁卵泡数目增加，尤其是长期睡眠呼吸暂停雌性大鼠。此结果提示睡眠呼吸暂停会引起雌性大鼠生殖系统毒性，降低卵泡质量，影响卵泡功能。
目前虽然已知病理性睡眠模式可损害女性生殖健康，但具体机制如何，有待进一步研究。雌激素在女性生殖发育过程中具有重要意义，雌激素可通过与ER结合介导其在下丘脑-垂体-卵巢轴中的作用，此时ER作用改变，从而影响其正常生理功能，诱发多囊卵巢综合征、子宫内膜癌等疾病的发生［9-11］。既往研究认为，ER的α和β亚型均属于核受体超家族，在结构上高度同源，当ER缺乏时卵巢功能减退，卵巢卵泡闭锁加速，排卵数量减少，受孕能力降低，且流产率较高［12-14］。本研究分析大鼠卵巢组织中ERα、ERβ表达量及卵泡数量，结果显示，相比正常雌性大鼠，无论是短期还是长期睡眠呼吸暂停大鼠卵巢组织中ERα、ERβ表达量均降低，原始卵泡、初级卵泡、窦状卵泡数目降低，闭锁卵泡数目增加，尤其是长期睡眠呼吸暂停大鼠。此结果提示，睡眠呼吸暂停可引起卵巢损伤。
DCs是体内功能最强的抗原提呈细胞，是宿主免疫应答的重要组成部分，睡眠呼吸暂停时机体处于低氧状态会触发DCs表型和功能改变，与常氧状态相比，机体处于低氧状态时DCs成熟表型增加，MLR增强［15］。既往研究发现，睡眠呼吸暂停患者外周血DCs显著减少，且DCs减少与炎症环境共存，与白介素6水平呈负相关，可降低机体激活T细胞的能力，定植于血管内皮带来靶器官的损伤［16］。本研究发现，睡眠呼吸暂停发生后雌性大鼠DCs迁徙比例减少，MLR增强，尤其是长时间睡眠呼吸暂停状态下DCs改变更显著，与上述报道结果一致，提示睡眠呼吸暂停可能通过影响DCs来引起相关障碍性免疫损伤。
睡眠呼吸暂停的主要致病机制为间歇性低氧，体内频繁的低氧/再氧合过程与缺血/再灌注损伤类似，在此过程中大量活性氧（ROS）生成，导致细胞膜的过氧化和线粒体损伤，当ROS大量蓄积时激活下游TLR4/RelB通路放大免疫反应［17］。TLR4被认为是先天免疫系统的主要成分，是炎症信号转导的重要分子，报道显示，当体内蓄积大量ROS时TLR4被激活，在中性粒细胞和单核细胞上共表达上调，且上述免疫改变在治疗后明显逆转［18］。RelB为耐受性DCs的理想靶点，即RelB-Silenced-DCs在刺激下仍相对低表达共刺激分子，DCs协同刺激因子的表达与核因子κB家族密切相关，当RelB基因缺陷时DCs数量显著减少，降低迟发型超敏反应，最终引起细胞免疫应答损伤［19-20］。本研究基于睡眠呼吸暂停后DCs功能改变导致机体免疫损伤特点，进一步探讨其免疫损伤机制，结果显示，存在睡眠呼吸暂停的雌性大鼠DCs内TLR4、RelB表达量均升高，尤其是长期睡眠呼吸暂停雌性大鼠中升高更显著，因此有理由推测睡眠呼吸暂停发生后低氧致DCs表型和功能改变，由此引起与免疫损伤相关的ROS/TLR4/RelB激活现象，导致生殖毒性。
另外，为进一步明确睡眠呼吸暂停对雌性大鼠的生殖毒性，分析大鼠生育力，结果显示，与空白对照组比较，长期组妊娠率、活产率均降低。既往研究中认为子代生长发育情况也可从侧面反映卵母细胞质量，本研究结果发现，虽然3组活产子代小鼠出生21 d每日体质量均有所升高，但与空白对照组比较，短期组与长期组生长迟滞，尤其是长期组。上述结果进一步证实了睡眠呼吸暂停可引起雌性大鼠生殖毒性的结论。
综上所述，睡眠呼吸暂停可引起雌性大鼠卵巢功能减退，降低生育力，推测其可能通过改变DCs迁徙能力来激活TLR4/RelB，引起免疫损伤，从而导致生殖系统紊乱。
参考文献略
