GST pull down超完整实验步骤分享❗️
🎬实验原理
GST pull-down实验是验证酵母双杂交系统的体外试验技术，其原理是目的蛋白与GST融合表达，蛋白固定在谷胱甘肽（GSH）亲和树脂上，作为与目的蛋白亲和的支持物，起到“诱饵蛋白”的作用。 目标蛋白溶液通过柱子，从中可以捕获相互作用的“捕获蛋白”（目标蛋白）。结合物洗脱后，通过蛋白质印迹 (WB) 分析证实两种蛋白质之间的相互作用。
“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。
GST pulldown实验原理
🎬实验目的
体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用，用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。
🎬实验步骤
1️⃣GST蛋白的表达
1）将表达GST融合蛋白的质粒转入BL21大肠杆菌菌株中；
2）挑单克隆于3ml LA(LB+Amp)培养基中，37℃摇菌过夜，获得种子液；
3）将种子液稀释于50ml 2x YT A(YTG+Amp)培养基中，使起始OD600为0.1；
4）28℃，220rpm 摇菌培养2小时 ；
5）加入50μl 100mM IPTG，16～27℃摇菌培养 1～8小时；
6）收菌，将菌液倒入大离心管，2管/50ml 菌液，4℃ 5000rpmx5min离心，弃上清；
7）加入10ml PBS/管，重悬细胞，5000rpm 离心5min，弃上清；
8）超声破壁，将裂解液分入1.5ml离心管中，4℃离心12000rpm×10min，取上清；
9）吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮3min，离心（12000rpm,1min），取上清SDS-PAGE电泳，检测表达情况。
2️⃣准备50% GST琼脂糖凝胶
1）将原75%谷胱甘肽琼脂糖凝胶的浆液弹至混匀；
2）取677μl原液/管，3000rpm离心5min，弃上清；
3）加500μl PBS，颠倒混匀，3000rpm离心5min，弃上清，反复5次；
4）加500μl PBS，颠倒混匀，配成50%谷胱甘肽琼脂糖凝胶备用。
3️⃣GST蛋白的纯化
1）在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入20μl 50%谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B，4℃，摇床上摇，反应30min～60min；
2）3000rpm离心5min，弃上清；该琼脂糖凝胶上即结合了GST融合蛋白，（如果仅仅是做纯化效果检测或者蛋白表达量很高，可以只接合一次，如果要结合更多则接着往下做）；
3）在管中加入离心后的1.5ml新鲜制备的细胞裂解液的上清，4℃，反应30min～60min。3krpm离心5min，弃上清。重复该步骤多次，就可以使琼脂糖凝胶上结合6～10ml裂解液中的GST融合蛋白；
4）在管中加入预冷的200μl PBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以免打断珠子与蛋白的联接），轻晃悬浮珠子，将琼脂糖凝胶洗涤一次，3000rpm离心3min，弃上清；
5）反复三次（最后一次以小枪吸净珠子表面水膜，其余几次可以中枪吸，尽量吸净但不吸走珠子），即获得结合有GST融合蛋白的琼脂糖凝胶；
6）如果用于检测，在谷胱甘肽加入15～20μl 1×蛋白电泳上样缓冲液，在沸水浴中煮3min。12000rpm离心1min，取上清作SDS-PAGE电泳；
7）结合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱。
4️⃣检测
1）将结合有GST融合蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶悬浮在500μlNETN 缓冲液中加入20～30μl含有其他蛋白的溶液同时采用结合有GST空蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶平行操作作为对照；
2）在水平摇床上，4晃动4～8小时；
3）离心（3600rpm，2min）吸去上清，注意不要扰动底层的琼脂糖球珠；
4）加入200μl缓冲液对琼脂糖凝胶进行洗涤。注意加入缓冲液时要贴壁加，不要直接冲击琼脂糖凝胶，随后轻柔晃动，使其重悬即可；
5）低速离心（3000rpm，2min）吸去上清，注意不要扰动底层的琼脂糖凝胶；重复步骤的洗涤2～3次；
6）吸干琼脂糖凝胶上方的水层后，加入20～30μl 1×蛋白电泳上样缓冲液，沸水浴4min，冻存于-20℃；
7）做SDS-PAGE和Western检测另一个蛋白。
🎬实验注意事项
1️⃣实验第一步是融合表达GST标签的融合蛋白。在进行表达载体选择时，要考虑到载体表达蛋白量的高低、是否能被诱导剂诱导表达等因素，常用的载体是pGEX-4T-1。
2️⃣在进行蛋白的诱导表达时，可溶性表达温度很重要。当温度过高，载体易形成包涵体，若复性不顺利，蛋白没有活性，会影响后续的实验。故建议进行一个诱导温度的摸索，常见的诱导温度在16℃~25℃。
3️⃣诱导时间很重要，细菌在对数生长期时，是最佳的添加诱导剂诱导表达的时间。诱导时间过长的话，诱导剂不会被细菌代谢，会一直进行蛋白的诱导表达过程。诱导剂的浓度、诱导的时间、培养的温度，这些因素都是综合影响着蛋白的表达结果。
4️⃣GST-pull down 的对照问题
1）做SDS-PAGE时点一个input的蛋白（即B-6＊His）阳性对照，看一下Western操作过程中试剂、操作步骤有没有问题。
2）谷胱甘肽琼脂珠上只固定GST蛋白，inputB-6*His，用于做阴性对照，看一下是否GST会与input的蛋白相互作用。
🤳以上是GST-pull down实验的全部步骤，GST pulldown实验我们是专业的，欢迎大家咨询问题和交流经验❗️
