蛋白原核表达：从机制到操作的图文全解析（附关键步骤流程图）！

一、原核表达原理 

   1、原理概述

蛋白质表达技术是一种将目标基因插入合适载体后导入宿主细胞，从而实现目标蛋白质高效表达的生物技术手段。其核心在于通过基因工程手段，将目的基因与表达载体进行重组，构建重组表达系统，进而利用宿主细胞的转录和翻译机制，实现目标蛋白质的合成。这一技术为蛋白质的生产、研究和应用提供了强大的工具。

2、应用范围

蛋白质表达技术在生物医学领域具有广泛的应用价值，涵盖了多个重要研究方向。它不仅用于蛋白质的纯化，能够为后续的生物化学分析和结构生物学研究提供高纯度的蛋白质样品；还用于蛋白质的亚细胞定位研究，帮助揭示蛋白质在细胞内的分布规律及其功能机制。此外，该技术还可用于蛋白质结构域的分析，通过表达不同片段的蛋白质，深入研究其结构与功能的关系。更重要的是，蛋白质表达技术为蛋白质的体外功能分析提供了实验材料，助力科学家探索蛋白质在生理和病理过程中的作用，为疾病的诊断与治疗提供理论支持。

3、分类

蛋白质表达技术主要分为两大类：原核表达系统和真核表达系统。原核表达系统主要包括以下几种：

1. ①大肠杆菌表达系统：这是最常用的原核表达系统，具有遗传背景清晰、表达水平高、培养周期短、抗污染能力强、实验技术成熟、成本低廉等优点。

 2. ②芽孢杆菌表达系统：该系统具有分泌表达能力强、产物易于纯化等优点，适用于一些需要分泌表达的蛋白质。

 3. ③链霉菌表达系统：链霉菌是许多抗生素的生产菌株，其表达系统在抗生素相关酶的生产中具有重要应用。  

 4、大肠杆菌表达系统的优势 大肠杆菌表达系统因其独特的优势，成为原核表达技术中的首选平台。

其主要优势包括：

1. ①遗传背景清晰：大肠杆菌的基因组信息已被广泛研究，其遗传特性和代谢途径清晰，便于进行基因工程操作。 

2. ②表达水平高：大肠杆菌能够高效表达重组蛋白质，短时间内即可获得大量目标蛋白，满足实验和生产需求。

 3. ③培养周期短：大肠杆菌生长迅速，通常在几小时内即可完成一个生长周期，大大缩短了实验周期。 

4. ④抗污染能力强：大肠杆菌对环境适应性强，能够在一定程度的污染条件下生存，降低了实验失败的风险。 

5. ⑤易于生长和控制：大肠杆菌的培养条件简单，对营养要求低，易于大规模培养和控制。 

6. ⑥实验技术成熟：大肠杆菌表达系统的实验技术经过长期发展，已经非常成熟，操作流程标准化，易于掌握。

 7. ⑦成本低廉：大肠杆菌培养成本低，实验耗材和试剂价格相对较低，适合大规模应用。 

8. ⑧丰富的菌株和质粒资源：市场上有多种大肠杆菌菌株可供选择，这些菌株具有不同的特性，能够满足不同实验需求。同时，与之匹配的质粒种类繁多，可根据目标蛋白的特性选择合适的表达载体。  

 二、原核表达步骤 

   以下是原核蛋白表达的详细操作流程，每一步都至关重要，需严格按照操作规范执行，以确保实验成功。

1、转化 将构建好的重组表达载体转入感受态BL21/DE3表达菌株中。通常采用热激法或电转化法，具体操作需根据感受态细胞的制备方法和载体特性进行优化，确保高效率的转化。

2、扩大培养 1. 在500ml灭菌后的LB培养基中加入对应抗性的抗生素，浓度根据抗生素的种类和质粒的抗性基因进行调整，一般为终浓度50-100μg/ml。 2. 从转化平板上挑取单个菌落，连同枪头一起打入LB培养基中。注意挑取的菌落应大小适中，避免污染。 

3. 将培养基置于37℃摇床中培养，建议上午10点前开始培养，培养至晚上即可进行诱导。培养过程中需定期观察菌液的生长情况，确保菌液浓度达到预期。  

 4、诱导过夜 1. 取100μl诱导前菌液（标记为Pre-l），置于4℃冰箱中保存，用于后续的蛋白表达比较。 2. 向剩余的菌液中加入IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷），进行18℃过夜诱导。IPTG的终浓度一般为0.2mM，但可根据目标蛋白的诱导情况适当调整，如0.1-0.5mM。 3. 诱导过程中，注意保持培养条件的稳定，避免温度波动对蛋白表达的影响。  

 5、离心 1. 取诱导后的菌液100μl，将菌液转入落地离心机的塑料瓶中，注意配平。 2. 设置离心条件为25℃、4000rpm、25min，进行离心操作。离心过程中，确保离心机的温度和转速稳定，避免对菌体造成损伤。  

 6、菌体收集 1. 离心结束后，弃去上清，彻底倒干净培养基，确保菌体沉淀完全收集。 2. 用30-35ml Ni-A缓冲液（针对His标签蛋白）重悬菌体，转移到50ml离心管中。如果目标蛋白带有其他标签，需选择对应的洗脱液进行后续操作。  

 7、裂解 1. 在冰浴条件下，设置超声波破碎仪的功率为200W（实际有效功率约30%），工作周期为3秒开/3秒关，总时长9分钟。为确保裂解效果均匀，分3次操作，每次超声后颠倒混匀。 2. 裂解完成后，通过Bradford法检测裂解液中总蛋白浓度。蓝色反应指示蛋白已成功释放，记录蛋白浓度值，为后续实验提供参考。  

 8、离心去沉淀 1. 将裂解后的菌液置于4℃预冷的离心机中，设置离心条件为4000rpm、25min。 2. 离心过程中，确保离心机的温度和转速稳定，以充分去除未裂解的细胞碎片和杂质。  

 9、收集上清液 1. 离心结束后，小心转移上清液到另一干净的50ml离心管中，注意避免吸起沉淀。 2. 保留100μl上清液作为样品（标记为SUP），同时保留沉淀（标记为PPT），用于后续的蛋白表达分析。  

 10、平衡Ni柱 1. 用Ni-B缓冲液（高浓度咪唑，如400mM）冲洗柱子，去除杂质。通常冲洗体积为柱体积的5-10倍，具体根据柱子的大小和杂质情况调整。 2. 再用Ni-A缓冲液（低浓度咪唑，如20-50mM）平衡柱子，A/B各50ml通常足够平衡。平衡过程中，注意观察流出液的吸光度变化，确保柱子达到平衡状态。  

 11、孵育 1. 用上清液将填料悬起，倒回50ml离心管中，置于4℃冰箱中孵育1-1.5小时。 2. 孵育的目的是使His标签蛋白与镍离子充分结合，提高蛋白的纯化效率。孵育过程中，可定期轻轻颠倒离心管，确保蛋白与填料充分接触。  

 12、收集上清液 1. 将带有填料的上清液重新过柱子，保留过滤液100μl作为样品（标记为UB）。 2. 保留UB的目的是为了检测结合效率，通过后续的SDS-PAGE分析，评估蛋白与镍离子的结合情况。  

 13、洗脱 1. 用Ni-A缓冲液过柱，洗脱下来的主要是杂蛋白。取40μl Bradford试剂+15μl洗脱液，检测是否洗干净，保留100μl作为样品（标记为WS）。 2. 用Ni-B缓冲液洗脱目的蛋白，每次1ml，一般10ml可以洗脱完毕。同上检测到不再变蓝，洗脱下来的即为目的蛋白（标记为E）。洗脱过程中，注意控制流速，避免蛋白丢失。