科研干货 | WB和qPCR的实验重复有什么区别？

在科研领域，实验重复是保证结果可靠性的重要手段，然而对于细胞株 / 细胞系实验而言，确定是技术性重复还是生物学重复至关重要。

生物学重复

生物学重复这一概念，在实验领域有着举足轻重的地位。说白了，就是在相同的实验环境下，利用不同生物来源的样本进行实验操作。

就好比这样，要是咱们在同样的培养条件下，把三组来源不同的原代细胞培养起来，或者选三只遗传背景、饲养条件相同，但个体有差异的实验小鼠。接着，从每一组细胞或者每只小鼠身上，用相同的操作手法获取等量样本，用于后续实验，那这呀，就构成了三组生物学重复。

这么做的主要目的很简单，就是想看看实验结果在不同的生物个体间到底有没有普遍性。因为有时候，个体差异、生物本身的自然变异这些因素，很可能就会干扰到实验结果。要是没有生物学重复，那实验结论的可靠性就得打个问号了。

举个例子，像研究某种药物对肿瘤细胞生长的抑制作用时，情况往往会比较复杂。假设只用一株肿瘤细胞来做实验，即便最后得到了很显著的抑制效果，这结果也很难推广到所有的肿瘤细胞上去。为啥呢？因为不同来源的肿瘤细胞，基因表达、代谢途径这些方面可能都存在着差异。

技术重复

技术重复嘛，就是对同一样本在相同实验条件下进行多次测量或者重复处理。比方说，拿同一份DNA样本，用相同的PCR扩增体系和程序，重复扩增三次，这样可以检查扩增过程中出现的误差；或者对同一份蛋白质样品，用相同的方法测三次吸光度，确保测量结果靠谱。

技术重复主要是为了验证实验操作过程中的稳定性与精确性，比如人员操作手法、仪器稳定性、实验步骤的规范性等，最大限度地排除诸如人为操作失误、机器检测偏差等技术误差。举个例子，像做分光光度法测物质浓度，如果只测一次，要是碰到仪器读数不准、加样精确不等情况，结果可能就飘了。但要是多测几次，算算平均值，看看标准差，就能把这类误差缩到最小，让测量数据更扎实。

WB 实验重复的策略与考量

（一）聊一聊WB实验的那些事儿和可能出错的地方

WB实验，其实就是蛋白质免疫印迹，它把高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术结合起来，是分析蛋白质的一种手段。不过，这实验的技术误差来源挺复杂的。

就说蛋白提取这一步吧，不同的细胞或组织样本，裂解难度和条件都不一样。像肝脏组织，酶多、结构复杂，裂解时条件得严格控制，不然蛋白提取不充分或降解，后续实验就受影响。还有凝胶制备，浓度、均匀度、聚合程度都关键。浓度不对，蛋白迁移受阻，条带分辨率低；混合不均匀或聚合不完全，蛋白质迁移速度不一，条带就扭曲变形。抗体孵育也很关键，一抗和二抗的浓度、孵育时间和温度都得恰到好处。要是浓度高了、时间长了或温度高了，非特异性结合、反应增加，背景杂、带子多，实验特异性和准确性就降低了。而且，一块胶上的泳道有限，若在一块胶上对每个生物学样本都做三次技术重复，孔位不够。再者，所有样本在同一块胶上反应，一旦出现电泳电压不稳定、凝胶局部温度升高等问题，所有样本都受影响，无法充分暴露批次操作带来的差异，难以有效检测技术误差。

（二）WB实验重复的参考方案

做WB实验，可以这样设计。先设置对照组和实验组，比如对照组是正常培养的细胞样本，实验组是经过不同药物处理的细胞样本，对照组占一个孔，每种药物处理的实验组各占一个孔，构成一组。为了保证结果可靠和普遍，准备至少3份这样的实验组样本，即每组实验条件独立进行3次实验。在每组实验内，不再进行技术重复，也就是一次WB实验时样本不设复孔。这样既能通过生物学重复涵盖生物个体间的差异，保证结果普遍性，又避免了同一块胶上技术重复的局限性，让实验操作更可行、科学。后续数据处理时，对3次生物学重复的数据统计分析，计算平均值和标准差，评估结果稳定性和可靠性，得出更有说服力的结论。

qPCR 实验重复的设计与优势

（一）96孔板咋提高效率

qPCR（实时荧光定量聚合酶链式反应）是一种在DNA扩增时，用荧光化学物质测每次PCR循环后产物总量的方法。在qPCR实验中，96孔板的应用让实验重复变得超方便。它的通量高，在一次实验里能同时容纳多个样本反应。和其他实验器材比，96孔板能大大提高实验效率，节省时间和成本。比如研究多个基因在不同组织的表达差异，用96孔板就能把不同组织样本和内参基因放在同一板扩增，一次实验就能拿到大量数据。而且，高通量的特点让在有限资源下实现多次生物学和技术重复更容易，给实验结果可靠性加了层保障。要是用传统的单管PCR，完成同样数量的样本检测和重复实验，得耗费大量时间、试剂，操作还繁琐，容易引入更多误差。

（二）各孔独立的妙处

96孔板在qPCR实验中，每个孔都是独立反应的，和WB实验中的SDS-PAGE胶可不一样。在SDS-PAGE胶上，所有样本同步反应，一旦出现问题，像电泳电压不稳、凝胶局部升温，所有样本都会受影响，技术误差难以检测。但qPCR实验里，各孔反应互不干扰，每个孔都是个独立的微型反应体系。即便某孔加样时有微量误差，或反应中受环境因素轻微影响，也不会波及其他孔。这特性让在一块板内同时进行技术重复和生物学重复成为可能，能真实反映每个样本情况，排除反应体系干扰带来的误差，提升实验结果的准确性和可靠性。比如检测不同药物处理对细胞基因表达的影响，把不同处理组样本和技术重复样本分别放在不同孔反应，由于各孔独立，能清晰观察到每个样本基因表达变化，准确判断药物作用效果。

（三）qPCR实验重复方案设计

做qPCR实验时，可以参考以下方案来设计实验重复。先设置对照组和实验组，比如对照组是未处理的正常细胞样本，实验组是经不同药物浓度处理的细胞样本，如低、中、高浓度药物A处理的样本。对照组占一个孔，每种药物浓度处理的实验组各占一个孔，构成一组，这例里一组共4个孔。96孔板孔位多，可以放多个组同时反应。为保证结果可靠和统计学意义，需至少进行3次生物学重复。对于技术重复，给每个样本另外设2个复孔，这些技术重复孔可以和生物学重复孔放一块板里同时反应。也就是每个样本做3次技术重复和3次生物学重复，基本能满足96孔板的孔位需求。后续数据处理时，对重复实验的数据进行统计分析，算算平均值、标准差和变异系数等参数，能更准确地评估实验结果的稳定性和差异显著性，得出更科学、更有说服力的结论。

从数据处理看两者差异

WB实验数据处理

在WB实验里，主要看蛋白质条带的灰度值来定量。用像ImageJ这样的图像分析软件，处理曝光后的WB条带图像，测出条带灰度值，代表蛋白质相对表达量。因为样本在不同泳道电泳和检测，受抗体批次、转膜效率等因素影响，所以数据处理时会选个内参蛋白，比如β-actin、GAPDH等，它们在细胞和组织中稳定表达。把目标蛋白灰度值和内参蛋白灰度值归一化处理，消除实验操作差异，得到较准的目标蛋白表达量。比如研究药物对细胞内蛋白表达影响，测出对照组和实验组目标蛋白及内参蛋白条带灰度值，目标蛋白灰度值除以内参蛋白灰度值，得到归一化后的相对表达量，再统计分析多组生物学重复的相对表达量，算平均值、标准差，用t检验或方差分析等方法看实验组和对照组有没有显著差异。

不过，这种基于条带灰度值的定量方法有局限，条带灰度值受抗体特异性、结合效率、曝光时间等因素影响。抗体非特异性结合会让条带背景升高，影响灰度值测量；曝光时间不对，条带过深或过浅，不能真实反映蛋白表达量。而且WB实验通常只能测目标蛋白相对表达量，实现不了绝对定量。

qPCR实验数据处理

qPCR实验的数据处理是基于荧光信号变化来定量。在反应中，荧光染料或探针与扩增产物结合，随着扩增循环数增加，荧光信号变强。通过检测荧光信号达到设定阈值时的循环数（Ct值）来确定起始模板含量，Ct值和起始模板对数呈线性关系，起始模板多，Ct值小。

数据处理时先校正和均一化Ct值，校正消除加样误差、仪器检测误差等系统误差，均一化是选合适的内参基因，像β-actin、GAPDH、18S rRNA等，比较目标基因和内参基因的Ct值，消除样本间初始RNA量或cDNA合成效率差异。用2-ΔΔCt法算目标基因相对表达量，以对照组为参照，算出实验组和对照组的ΔCt值（ΔCt = Ct目标基因 - Ct内参基因），再算ΔΔCt值（ΔΔCt = ΔCt实验组 - ΔCt对照组），最后用公式2-ΔΔCt算出目标基因在实验组相对于对照组的相对表达倍数。

对多组生物学和技术重复的相对表达量统计分析，算平均值、标准差、变异系数等参数，通过t检验、方差分析或非参数检验等方法判断组间差异有没有统计学意义。qPCR数据处理相对精确，能实现基因表达量相对定量和绝对定量。通过标准曲线法，用已知浓度标准品建Ct值与模板浓度的线性关系，可算出未知样本中目标基因的绝对含量。但qPCR对实验操作和数据处理的规范性要求高，一个环节出偏差，结果准确性就受影响。