【保姆级实验protocol 2】组织蛋白提取和浓度测定

组织蛋白提取和浓度测定是很多实验的前置步骤，所以很自然的，也是很多实验的基础和成功的关键。

同样分享本人操作的方法，可能有缺点和不足，欢迎讨论。

1.    物品准备：

待测组织样本，RIPA（裂解液），PMSF（是一种丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶不可逆抑制剂），磷酸酶抑制剂（防止蛋白去磷酸化，需要看蛋白质磷酸化水平时需要使用），磁珠/锆珠，匀浆机，准备碎冰，标记EP管，低温离心机，移液枪，枪头。

2.    蛋白提取步骤：

1）       根据实验计划和分组，仔细标记离心管；

2）       组织样本的准备：冰上/干冰称取标本20-50mg放入匀浆管中；

3）       裂解液体系：RIPA组织细胞蛋白裂解液，加入PMSF（苯甲基磺酰氟，）及磷酸酶抑制剂防止蛋白分解和磷酸化（根据使用说明书，一般终浓度1mmol/L或1X）；

4）       匀浆管中放入5-6颗磁珠，组织裂解液500-800ul。此处可以根据组织的大小，加入的裂解液越多，蛋白浓度会越低，所以建议不要加入过多裂解液。

5）       放入研磨器：6500rpm 30s 多次，迅速取出，冰上降温，随后看一下组织是否被完全匀浆，如未完全匀浆，重复多次直至完全看不到组织碎片；

6）       取出后 将匀浆管在冰上裂解 1h；

7）       随后将液体转移至EP管中，13000rpm 离心10min，上清液为所需蛋白质，一般上清液较为澄清，可保存在-80冰箱，最好尽快检测浓度。

蛋白浓度检测（BCA法）

1、准备：打开烘箱设置37℃，取出样品冰上解冻。

2、配制：设计好96孔板加样顺序，在孔中依次加入15ul RIPA裂解液，配置BCA工作液（200ul/孔，A:B 50：1）。样品解冻后涡旋混匀，各取5ul加样，每孔加入BCA工作液200ul 后预约检测时间，放入37℃烘箱计孵育30min，每孔液体总量220ul。 标准曲线空加样如下

标准曲线配置：两种方法均可。

3、测浓度：使用紫外-可见分光光度计,在 562nm 波长下测定混合液的吸光度。并可以根据标准曲线得出样品浓度。