RNA的提取你还不会吗？

RNA的提取

首先是收集细胞或者研磨碎的组织，加入trizol提取RNA，然后逆转成cDNA，最后是跑q。

（1）收集样本：

细胞：可以将贴壁细胞胰酶消化之后离心或者悬浮细胞收集起来离心，或者直接用细胞刮或者枪头刮下来，可直接将细胞拿到生物安全柜不用无菌操作，主要是防止吸入trizol，有毒），弃掉培养基（也可把培养基收到-20，用于后续做Elisa）用生理盐水或者1×PBS轻轻洗2遍，弃干净液体之后加入trizol，6孔板的细胞加入500μL trizol。（最好是500，要是没有，刚好覆盖就可以，200μL也勉强可以，也不需要太多，直接在细胞上加入trizol是我比较喜欢的方式。）

每10cm2（即3.5cm直径的培养板）加1mL，用移液器吸打几次。trizol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。

trizol加量不足可导致提取的RNA有DNA污染。

组织：每50-100mg组织加入1mL trizol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过trizol体积10%。若没有匀浆仪，可按照以下方式：取皮肤，剪碎，研磨，用胶原酶消化1h，但是发现这样做流式时细胞状态不好，死细胞太多了，直接剪碎的皮肤也可以提取出RNA，所以之后就直接取皮肤，尽可能取多一点，然后放在EP管中，有剪刀充分剪碎。然后直接加入trizol，每只小鼠1mL trizol。（要先充分剪碎之后再加trizol，因为如果先加trizol，液体太多，不好剪碎。）

然后把样本放在-20过夜， 最好过个夜再提取，让RNA充分被抽提。

（2）RNA的提取：

1) 将匀浆样品在15-30℃放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。

2) 按氯仿：trizol=1:5加入100μL氯仿抽提（氯仿需在通风橱中加入），涡旋剧烈震荡15s，使trizol与RNA充分混匀，室温放置3min，如不能旋涡混匀，可手动颠倒混匀2min代替，CHCl3会沉在底部。

3) 4℃，12000g，离心15min，离心后样品分层：红色的有机层、中间层和上层无色的水相，RNA主要位于上层水相中，中间白色条带为蛋白质，将上层水相转移到新的无酶EP管中，切勿吸到中间白色蛋白质（如要分离蛋白质和DNA，可保留红色的有机相）。

4) 按异丙醇：trizol=1:2往新管中加入250μL异丙醇，上下颠倒混匀，室温沉淀10min（或者-20度过夜，如果觉得RNA含量比较少，可以-20放置过夜，这样提取出来的RNA浓度会更高），异丙醇沉淀水相中的RNA。

5) 记得离心时记住放置的方向，因为待会RNA会被离心到其中一侧。4℃，12000g，离心10min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现白色胶状沉淀，RNA沉于管底（若无沉淀，可加大转速继续离14000g）。

6) 弃去上清，用75%乙醇洗涤RNA沉淀。按75%乙醇：trizol=1:1加入500μL 75%乙醇，上下颠倒混匀，4℃，14000g，离心5min，弃上清（全程直接用大枪套小枪吸取，这样可以减少冲击力使液体荡起来，可以减少RNA的损失）。

7) 这一步可不需要，但是有的话， 260/280和260/230的比值会更加好。100%无水乙醇洗涤RNA沉淀。按100%乙醇：trizol=1:1加入500μL 100%乙醇，上下颠倒混匀，4℃，10000g，离心5min，弃上清（用大枪头套小枪头吸取上清，切勿吸走RNA，记得一定要小心一点吸取）。

8) 弃去上清之后，4℃，10000g，离心5min，空转5min，去除掉多余的水分，方便后续晾干。然后用10μL的枪头小心吸掉上清。

9) 打开盖子，放在通风橱把风速调至最大，（室温开口放置）放置10-20min干燥（大概10min就可以），等待RNA沉淀变透明即可，不要放置过久，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入10μL DEPC水，用枪头吸打几次，使RNA溶解（可在55-60℃放置10-15min以充分溶解RNA，不用也可以，直接震荡混匀，离心下来，开始测浓度）。

10) 检测RNA浓度，（记得调成RNA模式！ 260/280=1.8~2.0最优，260/230=2以上，越大越好。）光DNA污染，260/280不会低于1.8，因为纯的DNA为1.8左右，加了RNA会高于1.8。所以260/280小于1.8是蛋白质污染。若260/230比值在2.1左右，说明是正常的，说明小分子污染比较少，比如酚类。

260/280代表蛋白质污染的程度，260/230代表有机溶剂污染的程度。260/230偏小说明溶液中含有有机溶剂，理论上来说，会对酶的效率有影响。看你用什么东西提的了，用trizol的话，有时候260/230是会低点，关系不大。

A260:A230是分光光度计测量RNA溶液的浓度出现的数值，表示样品的纯度。

1、A260nm：核酸的吸收峰测，测RNA，DNA等的浓度用的。260nm是核酸分子吸收峰的波长，是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0.1至1.0。如果不在此范围，稀释或浓缩样品，使之在此范围内；如果吸光度小于0.05，检查是否存在操作因素（如移液不准确，样品内有悬浮物等）影响。

2、A230nm：测定碳源物质，如酚，糖类等浓度用的，是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估。A230表示样品在230nm的波长处出现了吸收。在A230处出现吸收峰的原因是样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等。

3、A260:A230可以表征样品的纯度，A260:A230的比值一般大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。

4、280nm是蛋白质的吸收峰。

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