protocol：提取RNA，逆转录和RT-qPCR

大纲：首先是收集细胞或者研磨碎的组织，加入trizol提取RNA，然后逆转成cDNA，之后是跑q。

（1）收集样本：

细胞：可以将贴壁细胞胰酶消化之后离心或者悬浮细胞收集起来离心，或者直接用细胞刮或者枪头刮下来，或者直接将细胞拿到生物安全柜不用无菌操作，主要是防止吸入trizol，有毒），弃掉培养基（或者把培养基收到-20，用于后续做Elisa）用生理盐水或者1×PBS轻轻洗2遍，弃干净液体之后加入trizol，6孔板的细胞加入500μL trizol。（最好是500，要是没有刚好覆盖就可以，200μL也勉强可以，也不需要太多，直接在细胞上加入trizol是我比较喜欢的方式。）

每10cm²（即3.5cm直径的培养板）加1ml，用移液器吸打几次。trizol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。trizol加量不足可导致提取的RNA有DNA污染。

组织：每50-100mg组织加入1ml trizol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过trizol体积10%。但是没有匀浆仪，按照以下方式也可以：提取过皮肤组织的RNA，之前试过取皮肤，然后充分剪碎，然后直接加入trizol，每只小鼠1mL trizol。（要先充分剪碎之后再加trizol，因为如果先加trizol，液体太多，不好剪碎。）

然后把样本放在-20过夜， 最好过个夜再提取，让RNA充分被抽提。

（2）RNA的提取：

1) 将匀浆样品在15-30℃放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。

2) 按氯仿：trizol=1:5加入100μl氯仿抽提（氯仿需在通风橱中加入），涡旋剧烈震荡15s，使trizol与RNA充分混匀，室温放置3min，如不能旋涡混匀，可手动颠倒混匀2min代替，CHCl₃会沉在底部。

3) 4℃，12000g，离心15min，离心后样品分层：红色的有机层、中间层和上层无色的水相，RNA主要位于上层水相中，中间白色条带为蛋白质，将上层水相转移到新的无酶EP管中，切勿吸到中间白色蛋白质（如要分离蛋白质和DNA，可保留红色的有机相）。

4) 按异丙醇：trizol=1:2往新管中加入250μl异丙醇，上下颠倒混匀，室温沉淀10min（或者-20度过夜，如果觉得RNA含量比较少，可以-20放置过夜，这样提取出来的RNA浓度会更高），异丙醇沉淀水相中的RNA。

5) 记得离心时记住放置的方向，因为待会RNA会被离心到其中一侧。4℃，12000g，离心10min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现白色胶状沉淀，RNA沉于管底（若无沉淀，可加大转速继续离14000g）。

6) 弃去上清，用75%乙醇洗涤RNA沉淀。按75%乙醇：trizol=1:1加入500μl 75%乙醇，上下颠倒混匀，4℃，14000g，离心5min，弃上清（全程直接用大枪套小枪吸取，这样可以减少冲击力使液体荡起来，可以减少RNA的损失）。

7) 这一步可不需要，但是有的话， 260/280和260/230的比值会更加好。100%无水乙醇洗涤RNA沉淀。按100%乙醇：trizol=1:1加入500μl 100%乙醇，上下颠倒混匀，4℃，10000g，离心5min，弃上清（用大枪头套小枪头吸取上清，切勿吸走RNA，记得一定要小心一点吸取）。

8) 弃去上清之后，4℃，10000g，离心5min，空转5min，去除掉多余的水分，方便后续晾干。然后用10μL的枪头小心吸掉上清。

9) 打开盖子，放在通风橱把风速调至最大，（室温开口放置）放置10-20min干燥（大概10min就可以），等待RNA沉淀变透明即可，不要放置过久，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入10μl DEPC水，用枪头吸打几次，使RNA溶解（可在55-60℃放置10-15min以充分溶解RNA，不用，直接震荡混匀，离心下来，开始测浓度就可以）。

10)  检测RNA浓度，（记得调RNA！ 260/280=1.8~2.0最优，260/230=2以上，越大越好。）光DNA污染，260/280不会低于1.8，因为纯的DNA为1.8左右，加了RNA会高于1.8。所以260/280小于1.8是蛋白质污染。若260/230比值在2.1左右，说明是正常的，说明小分子污染比较少，比如酚类。

260/280代表蛋白质污染的程度，260/230代表有机溶剂污染的程度。260/230偏小说明溶液中含有有机溶剂，理论上来说，会对酶的效率有影响。看你用什么东西提的了，用trizol的话，有时候260/230是会低点，关系不大。

A260:A230是分光光度计测量RNA溶液的浓度出现的数值，表示样品的纯度。

1、A260nm：核酸的吸收峰测，测RNA，DNA等的浓度用的。260nm是核酸分子吸收峰的波长，是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0.1至1.0。如果不在此范围，稀释或浓缩样品，使之在此范围内；如果吸光度小于0.05，检查是否存在操作因素（如移液不准确，样品内有悬浮物等）影响。

2、A230nm：测定碳源物质，如酚，糖类等浓度用的，是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估。A230表示样品在230nm的波长处出现了吸收。在A230处出现吸收峰的原因是样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等。

3、A260:A230可以表征样品的纯度，A260:A230的比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。

4、280nm是蛋白质的吸收峰。

（3）逆转录

反转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)，是指以mRNA为模板在反转录酶作用下合成的cDNA 第一链的PCR。该反应分为两步，第一步在单引物的介导和反转录酶的催化下合成RNA 的互补链cDNA;  第二步加热后cDNA 与RNA 链解离，然后与另一引物退火，并由DNA 聚合酶催化引物延伸生成双链DNA, 最后同常规PCR一样，扩增靶DNA。合成cDNA 第一链所用的反转录酶是一类依赖于RNA 的DNA 聚合酶。

目前常用的反转录酶主要有两种: 一种是来源于禽成髓细胞性白血病病毒的AMV（42℃） 反转录酶，另一种是来源于莫洛尼鼠白血病病毒 的MOMLV （37℃）反转录酶。反转录PCR（Reverse Transcription，RT-PCR）又称为逆转录PCR。 Real Time Quantitative Polymerase Chain Reaction实时荧光定量聚合酶链式反应。

其原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平。

Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。

Oligo(dT)是多聚胸腺嘧啶、T重复寡核苷酸，就是只有胸腺嘧啶组成的核苷酸链，仅产生所需要的cDNA。因为Oligo(dT)与mRNA的Poly(A)尾巴可以发生特异性结合，所以用Oligo(dT)特异结合到mRNA上Poly(A)尾端，以此可以特异地将mRNA从总RNA中分离出来。

实验材料：DEPC水，RNA样本，Oligo(dT)，dNTP，逆转录酶，RNase抑制剂，buffer等。

实验步骤

逆转录PCR大致需要两个步骤，第一步是随机引物和RNA结合，根据 mRNA 分子的 3' 端有 poly (A) 尾结构的原理，用 12~20 个核苷酸长的 oligo （ dT ）与纯化的 mRNA 混合， oligo （ dT ）会与 poly (A) 结合作为反转录酶的引物，反转录反应的产物是一条 RNA-DNA 的杂交链。第二步是cDNA链的延长，cDNA 第一链的 3' 末端常常出现发夹环的特征，这种发夹结构是反转录酶在第一链末端“返折”并且进行复制第一链的结果，它为合成 cDNA 第二链提供了有用的引物。选用20μl体系，具体操作如下：

1) 准备无RNA酶的200μL EP管，按照以下表格准备体系1（或可把体系2的DEPC水加入体系1，共13.5μl：1000ng 20μl体系，如果达不到1000ng可以500ng10μl体系稀释10倍使用；或者600、700、800、900ng 20μl体系，后来相应稀释6、7、8、9倍。因为正常的话是20μl体系，后面再稀释10倍使用。

2) 将体系1加入200μl EP管中，先离心，震荡混匀，后再离心，PCR仪65℃，5min，使引物结合，体系选择10或者11μl。

3) 加入体系2，先在一个EP管内配成Mix（3μl DEPC水也可以在体系1的时候加入，不过我自己的话还是习惯后面再加，其实都是可以的）：（比原本想要的样本数多配一管，配好后把液体混匀离入管底）。

4) 往刚刚的200μl EP管中各加入体系2（混匀，然后再离心），瞬离把液体离入管底。每管是9.5μl。

5) PCR仪42℃×1h，70℃×5min，4℃∞。结束之后我比较习惯先稀释10倍放到-20冰箱，这样可以避免反复冻融。也可以之后要跑Q的时候再稀释。记得稀释后的和原管做好标记，我习惯的是在稀释管的上面标一个小点，类似于提RNA中标记RNA会离到哪一侧的标记。

稀释方法：将逆转录得到的cDNA吸出10μl用90μl DEPC水1:10稀释到100μl，相当于稀释10倍。

实时荧光定量多聚核苷酸链式(Real-time Quantitative polymerase chain reaction)RT-qPCR SYBR Green 法

准备：96孔板、封板膜、板架、SYBR Green、DEPC水、实验所需Primer、逆转录得到的cDNA。（10μl体系)

1.实验体系mix1（5.8μl），每种引物的mix1要看有多少个样本，样本数=分组×每组的样本数×点样重复次数。每种引物一点，规则为每10个样本多配一个，例如10个样本配11个，17个样本配19个。每10管增加1管，不足10管，按10管来算。配好后离入底部，混匀，离心。

2.实验体系mix2（4.2μl），每个样本的mix2，要看有多少种引物需要跑，记得加上内参，内参可以是actin或者GAPDH。数量等于引物种类数量×点样重复次数，但是要多配制一点，配制规则同上述方法。每10管增加1管，不足10管，按10管来算。每种引物一点，规则为每10个样本多配一个，例如10个样本配11个，17个样本配19个。配好后离入底部，混匀，离心。

分成两个体系来配置的好处是：不需要吸取小体积，先配成大体积再分装，这样可以减少吸取误差。

3.向96孔板中（不是养细胞的那种96孔板，特别的）靠孔侧壁每孔各加mix1（5.8μl）+mix2（4.2μl）。封板膜封板。离心30秒。开电脑，上机，开PCR仪，放PCR板子要匹配好，要放置好，嵌进去。close lid。open-protocol-plate-SYBR Green only-10μl体系-start run。设置好就可以忙其他的，刚开始仪器会初始化一段时间，待会要回来确认是否已经在running，一般都会，但是为了保险起见，还是检查一下。

也可以把这个protocol保存下来，以后就不用每次都设置，直接开始，不过开始之前要检查一下是否程序是对的，以免之前被别人不小心改到了。

4. 程序如下：

1.95℃10min，

2.95℃2s，60℃20s，70℃10s，+Plate Read，重复40次或更多，

3. Melt Curve 70℃ to 95℃ for 5s，increment 0.5℃+Plate Read。End。