灌胃牙龈卟啉单胞菌对2型糖尿病小鼠结肠机械屏障及免疫屏障影响的研究

牙周炎是由菌斑微生物感染引起牙周组织的慢性炎症性疾病，是导致成年人牙列缺损、缺失的重要原因，还与多种代谢性、炎症性和自身免疫性疾病如2型糖尿病（T2DM）、高脂血症、动脉粥样硬化性血管疾病和类风湿关节炎等密切相关［1］。T2DM是发病率增长最快的代谢性疾病［2］，其主要特征是胰岛素分泌相对不足和胰岛素抵抗，其致死率仅次于心血管疾病和肿瘤。研究发现，牙周炎与T2DM存在相互促进的关系，T2DM是牙周炎的重要危险因素，同时牙周炎也可能影响T2DM的发生发展［3-4］。

近年来，多项研究证实，牙周炎特异性菌群能通过肠道菌群及肠道屏障对全身多器官疾病产生影响，呈现“口-肠-多器官”模式，如结肠炎、关节炎、脑病、糖尿病、高脂血症等［5-7］。牙龈卟啉单胞菌（Pg.）是牙周炎的主要致病菌，研究发现，其能够随吞咽进入肠道，引起肠道微生物区系组成发生改变，导致肝脏、脾脏、肠道等器官出现炎症反应［8］。结肠黏膜的厌氧和高pH环境更有利于Pg.的黏附［9］，一旦发生菌群失调，有害细菌占据主导地位，会引起宿主肠道免疫状态以及肠道屏障功能受损，细菌毒素和代谢物等毒性物质可能通过肠道进入体循环中，导致身体远处各组织和器官受损［10］，进而增加了以低度炎症为特征的其他系统性疾病的发病风险，而Pg.引起肠道屏障破坏及免疫失衡的具体机制尚不完全明确。

本研究建立T2DM小鼠模型，通过灌胃的方式，模拟牙周炎患者唾液内Pg.随吞咽动作进入肠道，观察肠道炎症及紧密连接蛋白变化，以及其与血糖变化之间的关系，探索Pg.是否通过改变肠道免疫屏障和机械屏障功能影响糖代谢。

1　材料与方法

1.1　实验材料

1.1.1　实验动物：2022年5月—2023年2月，40只6~8周龄C57BL/6J雄性小鼠，SPF级，体质量20~22 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司（动物许可证号：110322220102485742）。实验小鼠适应性喂养1周后进行实验，期间12 h光照和12 h黑暗交替循环，温度（24±1）℃，湿度（60±10）%，小鼠自由摄食、饮水。动物实验于贵州医科大学实验动物中心完成，通过贵州医科大学实验动物伦理委员会批准（审批号：2201457）。

1.1.2　主要试剂：链脲佐菌素（STZ）（索莱宝科技有限公司，货号：S8050）；Pg.株（ATCC33277）（北纳生物，货号：BNCC236547）；小鼠脂多糖（LPS）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（华美生物，货号：CSB-E09308H）；脑心浸液琼脂（BHI）固体培养基（索莱宝科技有限公司，LA0360）；Trizol（Takara，货号：9108）；cDNA反转录试剂盒（Prime ScriptTM RT masters Mix，Takara，货号：RR036A）；TB Green Premix Ex Taq（Takara，货号：RR820A）；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司，货号：G1003）。主要仪器：罗氏卓越精采型血糖仪；实时荧光定量PCR仪（Bio-RAD）；Infinite F50经济型光吸收酶标仪（TECAN）；无菌厌氧箱（AW500TG）（ELECTROTEK）；低温高速离心机（Thermo Fisher）；高速低温组织研磨机（武汉赛维尔生物科技有限公司）。

1.2　实验方法

1.2.1　实验分组与建模：适应性喂养1周后，采用随机数字表法随机选取24只小鼠用于T2DM建模，采用高脂饮食（标准60%脂肪供能纯化型饲料）连续饲养4周，期间自由摄食、饮水。其余16只小鼠随机分为空白对照组（N组，n=8）和Pg.组（n=8），同期给予对照饲料（35%脂肪供能饲料）喂养。建模小鼠腹腔注射30 mg/kg的2% STZ，1周内连续腹腔注射3次，N组腹腔注射相同体积的0.1 mmol/L（pH=4.5）的柠檬酸缓冲液，以2次空腹血糖（FPG）≥11.1 mmol/L或随机血糖≥16.7 mmol/L为T2DM成模标准，保留成功模型（21只），随机选取16只分为模型组（DM组，n=8）和模型+Pg.组（PD组，n=8），建模成功后更换为35%脂肪供能饲料继续饲养。

1.2.2　Pg.株用BHI固体培养板37 ℃厌氧环境（80% N2、10% H2、10% CO2）培养7 d。转移至BHI液体培养基增菌16~18 h，于细菌生长对数期时，以3 500 r/min离心5 min（离心半径8.6 cm），弃上清液。用无菌磷酸缓冲盐溶液（PBS）重悬细菌沉淀后，测量细菌悬液吸光度，调整浓度为1×109 CFU/mL。于第7周起Pg.组和PD组灌饲200 μL含1×109 CFU/mL Pg.的菌液，2次/周，DM组和N组灌饲等量无菌PBS，连续灌饲5周。

1.2.3　建模后和灌胃后每日（或者隔1日）观察小鼠的精神状态、活动情况、毛发色泽变化、垫料干湿情况等一般状态。检测小鼠体质量变化及FPG，1次/周。在5周末进行口服葡萄糖耐量试验（OGTT）：隔夜禁食12 h，对小鼠按2 g/kg剂量灌胃25%葡萄糖注射液，在0、30、60、90、120 min时间点尾静脉采血，使用血糖计测定血糖值。绘制OGTT曲线，计算曲线下面积（AUC）。

1.2.4　灌胃5周后，1.25%阿佛丁（0.2 mL/10 g）腹腔注射麻醉小鼠后心脏取血收集血液，后用5%水合氯醛（0.2 mL/10 g）腹腔注射麻醉处死，收集结肠组织（近盲肠段），取部分置于4%多聚甲醛固定，部分加入RNA稳定液置于-80 ℃冰箱用于后续检测。

1.2.5　心脏取血收集于1.5 mL离心管中，4 ℃过夜后于2~8 ℃，1 000×g离心15 min，取上清液，按照小鼠LPS ELISA试剂盒说明书步骤加样，全自动酶标仪测定450 nm处的吸光度（OD值），绘制标准曲线计算得相应浓度。

1.2.6　实时荧光定量PCR（qPCR）检测结肠紧密连接蛋白及炎症因子：称取0.1 g结肠组织，低温高速组织研磨机进行研磨，Trizol法提取RNA，超微量核酸分析仪测量总RNA浓度。根据逆转录试剂盒，将提取的总RNA反转录为cDNA。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参基因，使用TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ进行qPCR检测，每样本设置3个复孔并计算mRNA的相对表达，引物由生工生物工程股份有限公司提供。引物序列见表1。

1.2.7　取固定好的结肠样本进行梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋切片，HE染色，于光学显微镜下观察小鼠结肠组织病变。

1.3　统计学分析

采用SPSS 27.0软件进行数据分析，采用GraphPad Prism 9.0软件绘图。符合正态分布的计量资料以（x±s）表示，多组间均数比较采用重复测量方差分析或单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验或Bonferroni法；不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间两两比较采用Kruskal-Wallis H检验。采用Pearson相关性或Spearman秩相关分析探究小鼠FPG与结肠紧密连接蛋白mRNA表达及血清LPS含量的关系。以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　4组小鼠一般状态及体质量比较

N组和Pg.组小鼠充满活力，毛发柔软有光泽，垫料干燥，DM组和PD组精神低落，运动较少，垫料潮湿，毛发暗淡，有刺激性气味，饮食及饮水量增加。灌胃前第2~6周小鼠体质量比较，差异有统计学意义（P<0.05）；灌胃前第2~6周DM组体质量高于N组、Pg.组，差异有统计学意义（P<0.05）；PD组第2~6周体质量高于N组，第3~6周PD组体质量高于Pg.组，差异有统计学意义（P<0.05）。第1周4组小鼠体质量比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表2。灌胃后重复测量方差分析结果表明，组别与时间对小鼠体质量存在交互作用（P交互<0.01），组别与时间对小鼠体质量主效应均显著（P组间<0.01，P时间<0.01）。第9~11周N组、Pg.组体质量高于DM组、PD组，第11周PD组体质量低于DM组，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。

2.2　4组小鼠血糖情况

灌胃前第3~6周4组小鼠FPG比较，差异有统计学意义（P<0.05），其中第3~6周PD组高于N组、Pg.组，第4~6周DM组高于N组、Pg.组，差异有统计学意义（P<0.05），第1~2周4组小鼠FPG比较，差异无统计学意义（P<0.05），见表4。灌胃后重复测量方差分析结果表明，组别与时间对小鼠FPG存在交互作用（P交互=0.021），组别与时间对小鼠FPG主效应均显著（P组间<0.01，P时间<0.01）。第7~11周Pg.组FPG低于DM组、PD组，PD组高于N组，第10、11周PD组高于Pg.组，差异有统计学意义（P<0.05），见表5。

组别与时间对小鼠OGTT试验各时间点血糖存在交互作用（P交互=0.013），组别与时间对小鼠血糖主效应均显著（P组间<0.01，P时间<0.01）。0~120 min DM组高于N组、Pg.组，PD组高于N组、DM组、Pg.组，120 min Pg.组高于N组，差异有统计学意义（P<0.05），见表6。4组小鼠OGTT AUC及血清LPS含量比较，差异有统计学意义（P<0.01），其中DM组AUC高于N组、Pg.组，PD组高于N组、DM组、Pg.组，PD组LPS高于N组、DM组，差异有统计学意义（P<0.05），见表7。

2.3　4组小鼠结肠紧密连接蛋白及炎症因子mRNA表达水平

4组小鼠紧密连接蛋白1（ZO-1）、闭合蛋白、白介素（IL）-17A、IL-10、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、Toll样受体（TLR）4比较，差异有统计学意义（P<0.05），其中PD组ZO-1低于N组，DM组闭合蛋白低于N组，PD组闭合蛋白低于N组、DM组、Pg.组，PD组IL-17A低于N组、Pg.组，N组IL-10高于DM组、Pg.组、PD组，PD组TNF-α高于N组、DM组、Pg.组，Pg.组、PD组TLR4高于N组，差异有统计学意义（P<0.05），见表8。

2.4　FPG与结肠紧密连接蛋白mRNA和血清LPS含量的相关性分析

相关性分析结果表明，FPG与LPS呈正相关（rs=0.635，P<0.01），与ZO-1（r=-0.377，P=0.034）、闭合蛋白呈负相关（rs=-0.746，P<0.01）。

2.5　4组小鼠结肠组织HE染色结果

结肠HE染色切片显示，N组结肠隐窝深度及形态结构正常，肠腺数量丰富，未见明显炎性细胞。Pg.组和DM组固有层可见结缔组织增生，伴淋巴细胞灶性浸润，局部间质也可见少量淋巴细胞浸润；而PD组固有层伴淋巴细胞灶性浸润；局部间质可见少量淋巴细胞浸润；黏膜下层轻度水肿，结缔组织排列稀疏，伴少量淋巴细胞浸润，结肠隐窝深度变浅，部分隐窝形态不典型，见图1。

3　讨论

每人每天可以分泌1.0~1.5 L的唾液。在生理条件下，由于受到胃酸和碱性胆汁的保护，唾液菌群很少到达肠道。然而，牙周炎患者的唾液菌群与口腔健康者明显不同［11-12］。牙周病患者的唾液中Pg.等有害菌丰度明显更高［13］。21~23岁重度牙周炎患者每天吞咽1012~1013个Pg.［14］。Pg.由于其抗酸性可能会通过胃酸到达肠道，破坏肠道内环境的平衡［10］。

在肠道内，肠道屏障由微生物屏障、黏液屏障、物理屏障和免疫屏障组成，构成了肠道抵御外部病原体的第一道防线，无论是哪一层肠道屏障的破坏，均可能会导致“肠瘘”的形成，肠道内细菌及代谢产物则可能通过肠道进入血液，加重多种系统的疾病，如关节炎、肝病、脑病、T2DM、炎症性肠病（IBD）、肥胖等［7，15-17］。本研究发现，Pg.灌胃后，肠道免疫屏障及机械屏障功能受损，T2DM小鼠的血糖调节能力和胰岛素敏感性降低，在高血糖的基础上，糖代谢紊乱进一步加重。

肠道免疫屏障主要由免疫细胞及其细胞因子组成，肠道免疫调节细胞作为肠道菌群与糖尿病之间的“桥梁”，免疫平衡的破坏伴随T淋巴细胞及细胞因子平衡紊乱，通过影响胰腺、肝脏等其他内分泌器官，对机体免疫状态、糖脂代谢和胰岛素敏感性产生不利影响［18］。CD4+ T辅助细胞（Th）在维持肠道免疫中起着关键作用，CD4+ IL-17+Th17细胞和CD4+CD25+Foxp3+ T细胞（Th17/Treg细胞）之间的平衡是免疫稳态的基础。肠道免疫失衡时常表现为Th17/Treg细胞及相关细胞因子比例失衡，表现为Th17相关促炎因子IL-6、TNF-α、IL-17A和IL-17F浓度增加，而Treg相关抗炎因子转化生长因子β（TGF-β）、IL-10则相应减少。本研究发现，灌胃Pg.后，T2DM小鼠结肠内促炎因子TNF-α的表达增加，而抗炎因子IL-10的基因表达进一步减少，HE染色结果显示，PD组结肠固有层及间质内炎症性病理变化较DM组和Pg.组更为明显，表明结肠内可能存在Th17/Treg比例失调，肠道免疫稳态破坏更加显著。其中IL-10不仅在免疫反应中起抗炎作用，近年来多项研究发现，其在糖尿病发展中也发挥一定保护作用。YUAN等［19］发现，T2DM患者外周血中Th17/Treg细胞百分率及相关细胞因子（主要是IL-10和TGF-β）水平显著降低。STZ诱导的非肥胖型糖尿病小鼠在接受携带有编码IL-4和IL-10质粒的细菌株联合治疗后，可以有效降低高血糖以及胰岛的破坏［20］。推测灌胃Pg.后IL-10的减少可能不仅通过影响肠道免疫影响血糖，还有可能是IL-10本身对血糖的直接影响。

肠道Th17/Treg存在免疫失衡时通常伴有IL-17A的增加。在胶原蛋白诱导的关节炎模型中，口服Pg.可诱导肠道免疫模式向Th17优势方向转变，并伴随肠道微生物区系的改变，加重小鼠胶原蛋白诱导的关节炎症状［21］。但也有研究发现，IL-17A可在多种组织中具有诱导促炎和抗炎反应两种作用［22］，在肠道中还可以促进上皮细胞增殖，上调抗菌肽和紧密连接蛋白的表达，从而保护肠黏膜免受各种病原体的感染［23］。应用IL-17A抑制剂或IL-17A受体（IL-17RA）抑制剂可削弱结肠炎小鼠肠道屏障，加重肠道炎症［24］。此外，有研究发现，高脂饮食小鼠其肠道内Th17/IL-17的减少与体质量增加，糖耐量减少及胰岛素抵抗具有相关性［25］。证明胰岛素敏感性降低在内的代谢性疾病早期与肠道微生物群多样性降低，以及IL-17/IL-22下降相关［26］。肠道中除Th17细胞外，自然杀伤细胞（NK细胞）、γδT细胞、CD8+ T细胞等多种细胞也参与IL-17的分泌，本研究中，灌胃Pg.后的糖尿病小鼠结肠IL-17A呈现减少趋势，并与紧密连接蛋白变化相一致。提示Pg.可能通过影响其他免疫细胞分泌IL-17进而对结肠紧密连接蛋白产生影响，而其具体机制有待进一步探索。

TLR是病原体相关分子模式识别受体，不仅表达在天然免疫细胞和特化抗原提呈细胞表面，也表达在CD4+ T细胞表面。其中TLR4可以识别并结合革兰氏细菌的LPS，激活核因子κB信号通路，引起肠道Th17/Treg细胞比例失调和胰岛素抵抗［27-28］，进而影响糖尿病的发展。

闭合蛋白、ZO-1是构成肠道紧密连接的主要蛋白因子［29］，常作为肠道机械屏障功能的检测指标。本研究发现，与N组小鼠对比，DM组和PD组结肠闭合蛋白的mRNA表达量均降低，而PD组的两种紧密连接蛋白的降低更为明显。表明无论是糖尿病还是单纯灌胃Pg.均可能对肠道机械屏障和免疫屏障产生一定影响。而在T2DM基础上进行Pg.灌胃后，肠道机械屏障和免疫平衡的破坏更为明显，并且血清内LPS含量显著增加；小鼠血糖变化与闭合蛋白、ZO-1的mRNA表达呈负相关，与LPS含量变化呈正相关，进一步证明，肠道屏障破坏导致的LPS入血可能是引起血糖变化的关键因素。

4　小结

综上所述，Pg.灌胃处理后，对结肠机械屏障及免疫屏障的破坏，在高血糖背景下更为显著，可能导致肠道内LPS入血，进一步加重糖尿病小鼠血糖调节及胰岛素敏感性受损。体外研究发现，LPS可以通过X盒结合蛋白1调控脂肪细胞胰岛素受体底物1、磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1、蛋白激酶B信号通路，影响胰岛素信号的传导［30］，因此，LPS可能是Pg.通过肠道引起远端器官糖脂代谢损害的重要靶点。对于Pg.对肠道屏障的破坏，推测一方面可能是由于灌胃Pg.后引起肠道微生物及代谢物变化的直接作用［31］；另一方面可能与肠道免疫平衡打破，如IL-17A、IL-10减少，TLR4、TNF-α等免疫因子增加有关。本研究进一步验证了Pg.可以通过口-肠途径影响糖尿病的发展，而其引起肠道免疫屏障、机械屏障破坏的潜在机制，以及LPS入血后对全身糖脂代谢的具体机制有待进一步探索。

参考文献略

引用本文：李萧纹，闫福华，陈文文，等. 灌胃牙龈卟啉单胞菌对2型糖尿病小鼠结肠机械屏障及免疫屏障影响的研究［J］. 中国全科医学，2024，27（18）：2225-2232. DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0386.