形态学免疫组化免疫荧光四部曲-苏木素&伊红染色

1. 背景知识介绍

1.1 苏木精-伊红染色原理

苏木精和伊红（hematoxylin eosin stain，HE）染色的原理是组织和染料之间的化学结合。苏木精是一种碱性染料，在酸性性（亲碱性）结构上形成蓝紫色，主要是那些含有核酸分子的结构，如染色质、核糖体和富含RNA的细胞质区域；伊红是一种酸性染料，将碱性（亲酸性）着色，会将红细胞、细胞质、肌肉和胶原蛋白（细胞质中大部分蛋白质是碱性的）等基本元素染成不同强度的粉红色、橙色和红色。

苏木精-伊红(H&E)染色是组织病理学中应用最广泛的染色技术。顾名思义，H&E染色使用两种染料的组合，即苏木精和伊红。这种组合能够将染色各种组织元素根据酸碱性区分开，主要是含有核酸区域（主要是细胞核-苏木精）和不含核酸区域（主要是细胞质-伊红），使它们易于观察。

1.2 苏木精

1.2.1 什么是苏木精

苏木精是从原木树的心材中提取的Hematoxylum campechianum，当氧化时，它会形成 Hematein，这是一种与某些金属离子形成强烈着色络合物的化合物，主要是铁（Fe）和铝（Al）盐，金属-血红素络合物用于在显微镜下检查之前对细胞核进行染色。

1.2.2 如何配制苏木精

将1.0克苏木精溶于10毫升乙醇(95%)中，用杵在研钵中溶解，将20克铵或钾明矾溶于200毫升温热的蒸馏水中。然后将上述两种物质混合在一起并迅速加热直至煮沸。且不断搅拌，然后再加入0.5克氧化汞。停止加热，并尽快使用自来水冷却。过滤上述混合物并储存在一个棕色或瓶子。染色剂在室温(20°C - 30°C)下稳定保存数月。

Table1 苏木精的配制

1.2.3 伊红

将1.0克黄伊红（Yellow eosin）溶解于约80毫升蒸馏水中。在此基础上加入320 ml 95% (v/v)乙醇，然后加入0.4 ml冰醋酸，拌匀即可。本溶液在室温(20°C - 30°C)下稳定保存数月。

2. 苏木精-伊红染色实操

苏木精-伊红染色的材料来自于上期推文包埋并切片的组织，不懂的回去读上一篇推文

（1）脱蜡：二甲苯两次，每次5min（可延长至10-15 min）。使石蜡溶出，保留组织片。

（2）复水（除脂肪外，让其余物质恢复到原始状态）：分别过100%（I）、100%（II）、90%、80%、70%酒精各5min。蒸馏水（或PBS）两次各5min。

（3）苏木精染色，2~5min（苏木精染色时间长一点没有关系），水洗（蒸馏水或自来水），去除多余苏木精（建议一边染色以便观察，染色OK即可停止染色）。

（4）分化：5% 冰醋酸溶液，浸泡30s左右，使苏木精浮色褪去，避免非特异性着色。

（5）返蓝，为苏木精提供弱碱性环境（自己配HCO32+等弱碱性水或者自来水），使苏木精显蓝黑色，自来水洗约15min。

（6）伊红染色 2-10s 不要过染（伊红绝对不能过染，配置的时间越长染色时间就越短），充分水洗去除浮色（建议一边染色以便观察，染色OK即可停止染色）。

苏木精对核酸着色，酸性条件显红色，碱性条件显蓝色。

（7）脱水（利于片子保存），分别过70%、80%、90%、100%酒精各10s。转移至干净的二甲苯当中浸泡1min。

（8）封片，封片是用吸水纸擦去组织块以外多余的二甲苯（从二甲苯中拿出要迅速操作，否则组织会氧化变黑），滴加中性树胶（将20μL的枪头剪一段，让中性树脂更容易被吸取），加盖玻片，用镊子轻轻按压，是树胶迅速扩散覆盖组织。动作要迅速，防止干片。

（9）封片后，玻片水平放置，待树胶完全干燥后，收存。

3. 苏木精-伊红染色结果解读

H&E与凋亡：凋亡迹象，核固缩和核分裂，染色质凝结，嗜碱性增高，膜起泡，细胞核深染，细胞形状拉长，空间变细，细胞间相互作用中断。

（图1 H&E 细胞凋亡解读 [1]）

H&E与炎症：组织中的炎症主要是看白细胞着色，一般白细胞会成团具体呈现粉红色。

图2 白细胞浸润(infiltration)呈现聚集的粉红色 [2]

H&E与睾丸组织细胞类型：曲细精管中主要有支持细胞，生殖类细胞，管周肌样细胞组成。

（图3 曲细精管细胞类型判断）

Spermatid: spermatid is a haploid male sexual cell formed after meiosis from spermatocytes that eventually matures into a spermatozoon.

Spermatozoa: the spermatozoa have a head, neck, middle section, and tail. The plasma membrane surrounds the whole sperm body.

2. 结束。

（爱自己！！！做科研!!! 每文格言“塔西佗陷阱:“塔西佗陷阱”，得名于古罗马时代的历史学家塔西佗。这一概念最初来自塔西佗所著的《塔西佗历史》，是塔西佗在评价一位罗马皇帝时所说的话：“一旦皇帝成了人们憎恨的对象，他做的好事和坏事就同样会引起人们对他的厌恶。”之后被中国学者引申成为一种现社会现象，指当政府部门或某一组织失去公信力时，无论说真话还是假话，做好事还是坏事，都会被认为是说假话、做坏事。”如果有用，关注楼主GBhouse，点赞+讨论是博主持续更新的动力！！！）

[1] Modulated Electro-Hyperthermia Supports the Effect of Gemcitabine Both in Sensitive and Resistant Pancreas Adenocarcinoma Cell Lines

[2] Effects of intravenous diltiazem in a rat model of experimental coronary thrombotic microembolism