[求助]关于多糖测定:苯酚--硫酸法

目前测量得结果比较混乱:
. 1. 标准曲线, 次测定都要做一个标准曲线,曲线得相关系数均在0.999以上,但是即使是同 一个葡糖糖对照品溶液,斜率还是有较大得变化,从C=kA, k在0.0989-0.113之间,C为浓度,mg/ml, A为吸光度, 问题就是标准曲线怎么让它稳定,
2. 沉淀 洗涤多糖的方法
我们得做法: 供试品溶液
称量1.0g样品粉末,于100ml容量评中,加80ml水,沸水浴2h,冷却定容,混匀,
过滤.弃初滤液,收集余下滤液,取5ml滤液至50ml离心管中,4000r/min,离心10min ,吸管吸上清液,并滤纸过滤,玻棒弄散沉淀,加10ml,80%乙醇混匀洗涤,4000r/min,离心10min ,以上两步骤再重复两次, 最后弄散沉淀加10ml80%乙醇,一并过滤,再用80%乙醇,洗滤纸至无单糖,
晾干,用沸水洗滤纸至50ml容量瓶中,溶解多糖,离心管,玻棒也要冲洗,冷却,定容,即供试品溶液
弃上清液怎么弃掉,是用吸管吸掉.还是倾倒掉
3. 比色: 加1.0ml溶液,1.0ml苯酚,混匀, 迅速加硫酸,5.0ml 沸水中两分钟,冷却,测定
原理是, 多糖溶液在高温下水解成单糖, 单糖被浓硫酸脱水成糠醛, 糠醛和苯酚反应生成有色物质, 问题是 为什么一定先加苯酚, 再加浓硫酸, 而且一定要迅速加, 多糖和苯酚会反应吗, 而且沸水浴时间很不一样, 有得2min,有得5min,有得还要静置5min, 再沸水浴中15min, 时间很有关系吗