《结直肠疾病》直肠脱垂病理特征：经肛吻合器直肠切除治疗出口梗阻型便秘患者的发现

Diseases of the Colon & Rectum (《结直肠疾病》)是美国结直肠外科医师协会（ASCRS）官方期刊，在威科医疗（Wolters Kluwer Health）旗下Lippincott平台出版。DC&R是公认的结肠、直肠和肛门疾病研究的权威期刊，出版原创研究、综述、简短通讯等文章。50多年来，DC&R一直是结直肠外科医生和胃肠病学家在此专业领域中交流与传播外科医学知识和信息的首选杂志。

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翻译：姚一博 上海中医药大学附属龙华医院，鲜振宇 中山大学附属第六医院

审校：竺平 南京中医药大学附属医院

 摘要 

背景：排便梗阻综合征是一种常见的多因素疾病，其治疗主要基于临床表现，缺乏可靠的检测工具和解剖病理学标准。

目的：分析出口梗阻型便秘患者行经肛吻合器直肠切除术切除的直肠标本的病理发现。

设计：本研究为回顾性队列研究。

设定：研究在一所大学附属医院进行。

患者：因直肠内脱垂导致的排便梗阻综合征而接受直肠切除术的患者。

干预措施：通过常规组织学和形态学图像分析排便梗阻综合征患者的标本，并与因肿瘤性疾病而切除的直肠标本进行比较。

主要结局指标：主要结果是研究直肠脱垂引起的解剖病理学改变。

结果：2017年1月至2020年12月，将经肛吻合器直肠切除术组46例标本与对照组40例标本进行比较。经肛吻合器直肠切除术组常规组织学检查显示：34例（73.9%）为中度-重度纤维化，33例（71.7%）为中度神经退行性变。在对照组的常规组织学检查中，31例（77.5%）显示无纤维化，而37例（92.5%）未发现神经退行性变。经肛吻合器直肠切除术组的形态学图像分析显示：中度纤维化有19例（41.3%），重度纤维化有25例（54.4%）。在对照组中，形态学图像分析显示11例（27.5%）标本的纤维化程度较低。在常规组织学和形态学图像分析评估中，两组间的所有纤维化和神经发育不良等级均存在显著差异（P<0.001）。

局限性：本研究样本量小且为回顾性研究设计。此外，没有采集健康志愿者的样本作为对照组。

结论：经肛吻合器直肠切除术标本显示出更高的纤维化和神经发育不良率；这是目前术前完全未纳入考量的重要参数，在不久的将来可能指导直肠脱垂患者接受最佳治疗方法。视频摘要见http://links.lww.com/DCR/B928。

关键词：形态学图像分析；排便梗阻综合征；直肠纤维化；直肠脱垂；直肠神经退行性变；经肛门吻合器直肠切除术

1、背景

排便梗阻综合征（obstructed defecation syndrome，ODS）是一种常见的多因素疾病，根据罗马IV标准进行定义，以排便时无法正确地排空直肠为特征^1,2。

ODS的病理生理学较为复杂，涉及功能和解剖学的改变，各种切除和悬吊术式被推荐用来治疗ODS^3–6。然而，由于长期结果并不令人满意，对于最有效的治疗方式仍存在争议。

Delorme术是治疗直肠内脱垂（internal rectal prolapse，IRP）引起的ODS的经肛切除方法之一；然而，关于其术后疗效的文献报道较少⁷。

最初由Longo描述的经肛吻合器直肠切除术（stapled transanal rectal resection，STARR），是最新和全球广泛采用的用于治疗因IRP导致ODS的切除手术之一⁸。通过经肛门直肠全层切除来纠正与ODS相关的解剖异常。相关文献报道并证明了该手术的安全性和有效性，并强调了如何通过手术恢复直肠解剖结构来显著改善患者的症状和生活质量^9–13。

关于ODS的经腹术式，腹腔镜腹侧直肠固定术（laparoscopic ventral rectopexy，LVR）联合或者不联合补片放置，作为一种悬吊式手术被用于绝大多数病例的治疗，在并发症和疗效方面取得了令人鼓舞的结果^14,15。

目前在ODS的治疗中，外科医生的完全选择基临床标准和自身的偏好，而不是基于可靠的仪器检查特征。事实上，文献中缺乏具体和大样本量的ODS患者测压和超声评估的数据，目前仅有少量的观察性研究报道¹⁶。

此外，文献中缺乏关于直肠解剖学评估及其与可能的直肠功能障碍相关的数据。只有两篇已发表的论文对直肠脱垂患者的直肠标本中肠神经系统（enteric nervous system，ENS）的病理改变进行了分析^17,18。

本回顾性研究将ODS患者行STARR术的直肠切除标本和肿瘤性疾病的直肠标本的病理结果进行了比较，以分析和强调直肠脱垂潜在的解剖病理学损伤。

2、方法

研究设计

本研究对因IRP相关ODS接受直肠切除术的患者进行回顾性分析。本研究遵守《赫尔辛基宣言》伦理原则。所有受试者均获得书面知情同意书。该研究方案得到了地区伦理委员会的批准。纳入了从2017年1月至2020年12月，转诊至本大学附属医院结直肠医学中心行ODS手术治疗的患者。

病例选择

只有在药物和康复治疗失败后，患者才接受IRP相关ODS的手术治疗。

纳入标准为Agachan-Wexner评分>16，且有IRP术前诊断依据（如排粪造影）的ODS患者¹⁹。排除标准为与既往手术治疗无关的肛门直肠疾病（如瘘管、脓肿、肛裂、炎症性肠病）、正在使用免疫抑制剂或抗凝剂、既往会阴放射治疗史和结缔组织疾病。

所有患者术前进行综合评估，包括既往肛肠病史、直肠指诊、排便梗阻评分（Agachan-Wexner评分）和肛门镜检查；50岁以上患者或40岁以上有结肠癌家族史的患者行结肠镜检查。同时记录患者的人口学资料和合并症。此外我们还进行了排粪造影、肛肠直肠测压和直肠内超声检查，以排除除ODS外的其他伴发结直肠疾病。此外，对有泌尿生殖系统症状的患者进行MRI排粪造影检查¹⁶。

所有患者均接受直肠全层切除，并对切除的直肠标本进行详细的病理学检查（STARR组）。

为了和STARR手术标本的组织学表现进行比较，我们将术前未接受局部放疗的直肠癌手术患者的直肠标本作为对照组。切片距肿瘤至少3厘米，并确定切缘无肿瘤。

由两名病理学家对STARR组和对照组的样本进行常规组织学（CH）和形态学图像分析（MIA），对分组和其他组织学分析结果施行盲法。

外科手术

切除的全层标本来源于：两把PPH（03/01）STARR（20例），两把大容量36吻合器STARR（12例），Transtar(CCS-30©)STARR（14例）²⁰。所有手术均由同一名经验丰富的结直肠外科医生完成，并按照Brusciano等人描述的方法进行²¹。

常规组织学(CH)

直肠标本的组织学诊断按照既往报道的标准执行²²。对纤维化和神经发育不良进行评估。病理学家采用了包括四度纤维化的评分系统（无：0%，低度：10%~40%，中度：40%~60%，重度>60%）。神经发育不良的形态特征是粘膜下神经丛增生，伴有“巨大神经节”和神经节细胞增多，粘膜固有层及粘膜下血管周围的神经纤维数量增加，粘膜内异位神经节细胞增多。通过钙网膜蛋白（Calretinin，CR，一种钙结合蛋白）和S100蛋白来检测神经发育不良：用Ventana Benchmark自动染色仪进行免疫组化分析，采用兔原代单克隆抗体，SP65用于CR蛋白的检测，4C49用于S100蛋白的检测（Ventana Medical Systems, Inc.），1:150稀释，37°下孵育44分钟。采用传统的亲和素-生物素过氧化物酶复合物（ABC）法（ultraView通用DAB检测试剂盒）。用不含一抗的切片作为对照。用苏木精复染后，装载切片并在光学显微镜下观察（Olympus，40倍放大）。对炎症细胞（淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和组织细胞）进行形态学评估。

形态学图像分析(MIA)

将直肠标本切成4μm的连续切片，脱蜡，然后再水化。随后采用天狼星红/快绿染色，方法如下：首先在室温下采用含有0.01%快绿FCF的苦味酸溶液进行染色，远离光线；随后在室温下用含有0.01%天狼星红F3B和0.04%快绿的苦味酸饱和溶液进行染色；最后脱水、清洗并采用合成介质固定。天狼星红和快绿可将胶原纤维染成红色，而非胶原纤维则呈绿色。²²

采用Sony 3CCD彩色摄像机与配备N-Plan平面光学系统的Leica LB光学显微镜相连接，采集天狼星红/快绿双染色切片的图像，并以最大光值放大（×100）。对检测到的数值通过RGB图像分割（红色：胶原纤维；绿色：非胶原纤维和视野总面积），并转换为像素密度单位；随后采用Leica Quantimet 500 IW图像分析仪，对所有的图像进行处理。每例图像均经采集、数字化和自动处理来选择和分析，每张切片至少10个视野²²。

用于MIA结果（纤维化程度）分类的分级量表如下：无：0%，低度：5%~10%，中度：10%~20%，重度>20%。

统计分析

所有统计分析均采用Stata 16（StataCorp）软件。除非另有说明，连续变量采用平均值及其标准差（SD）或中位数（SD）及其四分位数范围表示。分类变量采用频率表示。STARR组和对照组参数之间的差异通过Wilcoxon配对秩检验进行比较。双侧p<0.05被认为差异具有统计学意义。

3、结果

从2017年1月至2020年12月，对因IRP相关ODS而接受STARR手术的共计46份标本（38名女性和6名男性；平均年龄：57.4±7.3岁）进行了检测（表1）。对照组共计40例患者标本（33名女性，7名男性；平均年龄62.7±9.5岁）。术前、术后便秘平均评分、ODS症状持续时间及合并症如表1所示。术前排粪造影显示18例（40.9%）患者存在直肠-直肠套叠、直肠前突>4 cm，以及钡剂排空不全。其余26例（59.1%）患者存在直肠肛门套叠、直肠前突>4 cm与钡剂排空不全。

CH和MIA的结果详见表2。在STARR组的46例直肠标本中，CH结果显示有34例样本（73.9%）表现为中-重度纤维化（图1A和2A），33例（71.7%）存在中度神经变性，7例（17.4%）有重度神经变性，均匀分布于粘膜下神经丛和肌间神经丛。所有标本都至少存在纤维化或神经变性中的一种情况。

关于炎症，在患者组和对照组的肌肉中都没有发现慢性和急性炎症细胞，也无炎症细胞渗入粘膜下或肌间神经丛。

在对照组中，CH显示31例标本（77.5%）无纤维化，其余9例（22.5%）为低度纤维化；未见中度或重度纤维化；对照组有37例（92.5%）未发现神经变性（图1B和2B）。

在STARR组中，MIA显示中度和重度纤维化的病例分别有19例（41.3%）和25例（54.4%）。对照组中MIA显示无重度或中度纤维化；仅有11例（27.5%）存在低度纤维化。具体来说，在CH和MIA评估中，病例和对照组之间所有级别的纤维化和神经发育不良均存在显著统计学差异（P<0.001），但CH低度纤维化和低度神经发育不良除外。

4、讨论

ODS是一种影响生活且已被大量研究的与解剖和功能改变相关的疾病，但文献中仍然缺乏可以指导特定治疗方式的明确客观特征。作者在先前发表的一系列文章中，使用3D超声和高分辨率肛门测压对直肠进行了解剖-功能的综合评估，确定了一个在ODS患者中的降低的参数，即直肠壁总体积，代表直肠的肌肉体积¹⁶。其他几项研究发现了ODS患者的功能改变，与健康受试者相比，显示出直肠压降低和直肠-肛门梯度压改变^23–25。

然而，关于ODS以外的解剖病理学异常的数据在文献中仍然很少。据我们所知，这是对出口梗阻患者的解剖病理学结果（包括ENS的形态学改变）进行分析的最大规模的研究。此外，这是第一次将MIA与CH相结合来客观评估解剖病理结果。

在我们的系列研究中，通过MIA比较了接受ODS和其他疾病（如癌症）手术的受试者的直肠壁切片。结果表明采用STARR手术进行直肠切除术可以恢复直肠壶腹的解剖功能，切除的受损组织中具有统计学显著增高的中重度纤维化（73.9%）和粘膜下和肌间丛神经发育不良（89.1%）。相反，对照组所有患者（100%）均表现为无纤维化（77.5%）或低度纤维化（22.5%）和神经发育不良（分别为92.5%和7.5%）。对于不同的器官，如肝脏、胃或肾脏，以往采用图像分析可以比较满意地评估纤维化程度^26,27。然而就直肠而言，这种基于结构改变评估的方法在本研究中是第一次被采用，并且发现了直肠一旦变性就不能再恢复正常收缩功能的特征。在导致直肠壁萎缩的最重要因素中肯定包括肠纤维化。因此，病理学家们致力于采用一种自动图像分析方法，该方法能够分别通过与天狼星红和快绿的组织化学亲和力来区分胶原纤维和非胶原纤维。事实上，胶原纤维可以被认为是间质纤维化的形态学对应体，并且与组织中羟基脯氨酸的水平密切相关，羟基脯氨酸是一种众所周知的纤维化生化物^28–30。

神经发育不良是一个有争议的概念，其诊断取决于定性和定量的组织病理学标准，该标准随着时间的推移不断改进，阻碍了诊断的普及³¹。目前也无可用的评分系统，我们采用基于CR的评估，CR常被用作人类肠道神经病变组织病理学诊断的免疫组织化学标志物，在肠道肌和粘膜下神经元中均有表达。免疫组化分析显示，STARR组标本中CR和S-100蛋白过表达，显示出对照组标本中几乎不存在的高度神经发育不良。直肠脱垂患者表现为粘膜下层（SMP）的肠神经元减少，以及SMP和肌间平面（神经节减少症）的胶质细胞减少，且分布不规则。其他针对神经元细胞和起搏器细胞的特异性免疫组织化学标志物包括PGP 9.5、c-kit、synaptophysin、S100和CD56，已在肠神经系统固有肌层和肠道肌神经丛水平进行了研究。尽管神经发育不良与其他病理改变之间存在实质性差异，但神经发育不良与正常对照之间没有观察到差异³²。

Zorenkov和Bassotti已经在文献中描述了直肠脱垂患者ENS的改变^17,18。Zorenkov将ENS的扩散性改变描述为一种过度神经元增生症，这似乎与我们的发现相反。我们推测这一结果可能与本研究患者的平均年龄（57.4±7.3岁）比Zorenkov等人研究中患者年龄（28 岁）更高有关^17,18 。值得评论的是，年龄对ENS可能的影响已被一些著名的研究者描述和论证^33,34。此外，增生性改变可能仅代表ODS疾病中ENS改变的早期阶段，在晚期可能转变为发育不良-退行性改变。Zorenkov等人认为IRP患者的黏膜下神经节增生可能是在直肠壁慢性扩张后继发的，原因是直肠腔内压力升高¹⁷。与我们的发现一致，Bassotti等人发现与本研究相似年龄（60岁）的患者未发现任何神经节过多症。与我们的结果相反，他们没有观察到任何炎症变化和纤维化¹⁸。然而，所有这些发现都支持IRP相关排便梗阻存在肠神经病变这一概念。

随着ODS的不同临床症状（如脱垂、肠套叠或直肠膨出）的逐渐发展，肌肉层萎缩并伴有广泛的纤维化，以及这些患者中始终存在的ENS改变的证据，可能提示支持根治性手术的指征，如STARR，其可实现双重目标：切除受损的直肠组织和提升脱位的直肠壶腹。在目前的研究中，所有患者的术后平均Agachan/Wexner评分为7.1±1.8，STARR手术可改善ODS（表1）。此外，不可忽视的症状持续时间（31.3±3.2个月）可能是我们系列中组织变性（纤维化和神经变性率）高的原因。

许多不同的手术技术（即经阴道、经会阴、经肛门和经腹部）已被应用，目的是恢复正常的解剖结构。然而，很少有比较手术矫正的长期结果的随机试验报道。值得注意的是，考虑到上述ODS患者发生的解剖结构改变，手术治疗出口梗阻可能是一种可行的方法。我们认为，STARR手术成功的原因不仅在于非梗阻原因（切除直肠前突、肠套叠等），还在于解剖功能原因（切除直肠病变部分，该部分由于失去了神经肌肉结构而不再能够履行其功能！）。然而，目前尚无一种能够根据纤维化和神经发育不良的程度对直肠壁退变进行术前评估和分级的方法（即内镜下大体活检，如巨结肠疾病），可以为我们客观地确定患者的特定治疗（切除或悬吊入路）提供重要参数^35,36。因此，本研究的解剖病理特征可以促进进一步的比较研究来解决这一问题，并根据患者的术前直肠特征确定不同手术方式的效果。然而，在中长期随访中，在降低便秘评分方面，STARR手术和腹腔镜腹侧直肠固定术似乎都获得了显著且相似的结果，显示了IRP的多因素发病机制^37–39。

本研究有一些局限性。首先是样本量小。此外，没有机会使用健康志愿者的标本作为对照组。最后，该研究的回顾性设计不允许对病理学家设盲。

5、结论

ODS患者的直肠一旦开始出现退变和变性时即可发生不可逆的损伤，失去其应有的功能。在我们的研究中，STARR组显示出明显更高的纤维化和神经发育不良率，这是一个重要的参数，目前尚未进行术前评估，这可能会在不久的将来为IRP患者提供最佳治疗方式提供参考。还需要进一步更大规模的研究，比较排便评分系统和纤维化/异型增生的程度，以解决这个问题。

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