protocol 分享｜小鼠基因型的鉴定

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简介

用小鼠鼠尾或鼠趾或组织进行小鼠基因型鉴定。

原理

通过化学方法裂解鼠尾或鼠趾或组织，获得小鼠基因组 DNA 并通过 PCR 方法将其扩增，通过 DNA 水平电泳结果判断小鼠基因型。

用途

鉴定小鼠基因型。

材料与仪器

试剂：

NaOH、EDTA、Trizma base

基因型扩增试剂盒、琼脂糖、TAE 溶液、核酸染料

仪器：

眼科剪、镊子、金属浴加热器、PCR 仪

水平电泳设备（主机、电泳槽）

步骤

1、剪下小鼠鼠趾、鼠尾或组织适量（至少一个鼠趾或 0.5 cm 长鼠尾），放于 1.5 mL EP 管中。加入 100 μL A 液，混匀离心，在 100 ℃ 金属浴煮 1 小时，中间取出混匀离心一次。

2、煮完静置至室温，再加入 100 μL 的 B 液充分混匀，可立即测定基因型，也可 -20 ℃ 长期存放。

3、取上清，依据基因扩增试剂盒说明配置扩增体系，一般每个样本中加入 10 μL Taq 酶 Mix，2 μL 上清液，1x 引物各 1 μL，最后用 ddH2O 补至 20 μL。

注意同时制备空白对照（ddH2O 为模板）和野生型对照（野生型小鼠样本为模板）。扩增体系混匀离心后在 PCR 仪中进行扩增，扩增好的 DNA 短期 4 ℃ 存放。PCR 程序设置可根据引物设计进行调整，常规可考虑：

4、配制琼脂糖胶，按 60 mL 1xTAE 溶液加入 0.9 g 琼脂糖的比例配制，混匀后微波炉调至中高火加热 3 分钟，确认琼脂糖粉末溶解完全后待液体稍微冷却后，加入 6 μL 核酸染料，摇晃混匀倒入制胶板中等待凝固。

5、凝固时间约为 30 分钟，随后拔出梳子将胶放入电泳槽中，加入 TAE 溶液至漫过凝胶，每孔上样 10 μL，除了加入样本外，另外加入空白对照，野生型对照和 DNA ladder。水平电泳电压设置 120 V，时间根据条带大小确定，一般 20~30 分钟。电泳结束，在照胶仪下观测条带位置，判断小鼠基因型。

注意事项

1）保证清洁操作，其他物质的掺入可能导致出现杂带；

2）ddH2O 用新灭菌后的，或者使用 DEPC 水。

3）配置琼脂糖凝胶时，在琼脂糖完全溶解时加入核酸染料混匀后快速导入制胶板，避免冷却太长时间，避免降温出现絮状沉淀。

另外，倒入制胶板后若出现气泡，可用干燥枪头挑破，小的气泡不影响结果。

常见问题

1）出现杂带：与空白对照进行比较，首先检查是否 ddH2O 的问题；其次，检查退火温度是否适合该引物的扩增，一般退火温度低于引物 Tm 值 1~2 ℃。

2）不出现目的条带或条带很弱：与野生型对照进行比较，首先检查是否该结果即为该鼠正确基因型；其次，是否样本剪取过少或裂解不充足导致 DNA 量较少。

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