protocol 分享｜ 小鼠黑色素瘤皮下荷瘤模型
简介
B16F10 黑色素瘤皮下荷瘤模型操作简单，成本较低，可重复性强，实验周期相对较短，是研究黑色素瘤常用的动物模型。
原理
给小鼠皮下注射 B16F10 肿瘤细胞，肿瘤细胞迅速增殖生长，形成黑色素瘤。
用途
可用于研究目标基因、药物等在黑色素瘤发生发展过程中的作用。
材料与仪器
1. B16F10 肿瘤细胞；
2. C57BL/6 小鼠；
3. 试剂：PBS 缓冲液、胰蛋白酶溶液、75% 酒精消毒液；
4. 器材：离心机、15 ml 离心管、1.5 ml EP管、显微镜、1.5 ml 注射器、小鼠剃毛器、消毒棉球、游标卡尺。
步骤
1. 使用胰蛋白酶溶液将处在对数生长期的 B16F10 肿瘤细胞消化成单个细胞悬液，转移至 15 ml 离心管中，调整离心机转速至 1600 rpm，离心 5 分钟，弃上清；
2. 加入 5 ml PBS 缓冲液重悬细胞，进行洗涤，以 1600 rpm 转速离心 5 分钟，弃上清；
3. 加入 1 ml PBS 缓冲液重悬细胞，使用显微镜进行细胞计数；
4. 按照计数结果加入 PBS 缓冲液，调整细胞浓度为 5×106/ml，将细胞转移至 1.5 ml EP 管中；
5. 接种时小鼠体重控制在 18~22 g 左右。用小鼠剃毛器剔除小鼠右下方背部毛发，暴露皮肤，用 75% 酒精消毒液进行消毒；
6. 再次吹打、混匀细胞悬液。用 1.5 ml 注射器吸取细胞悬液，注射器针头斜面朝上进针入小鼠皮下，缓慢注入 100 ul 细胞悬液，使得每只小鼠接种 5×105 个细胞，随后旋转针头出针，用消毒棉球按压注射部位 1~2 分钟；
7. 注射后密切关注肿瘤生长情况，大约在第 7 天可见荷瘤部位有黑色硬块，即造模成功；
8. 每隔 1~3 天使用游标卡尺测量肿瘤体积，记录肿瘤最长径（a）和最短径（b），肿瘤体积计算方法：V = a × b × 0.5 × b （mm3）。
注意事项
1. 在注射 B16F10 细胞之前，要用 PBS 缓冲液洗涤细胞 1~2 次，避免细胞培养基中的血清等成分在小鼠体内引起排斥反应，影响肿瘤在小鼠体内生长；
2. 注射完成后应旋转出针、用消毒棉球按压注射部位 1~2 分钟，避免细胞悬液渗出；
3. B16F10 黑色素瘤在小鼠皮下生长速度较快，要注意控制实验周期，避免因为实验周期太长导致肿瘤生长过大，超出动物伦理允许范围。
常见问题
1. 不同小鼠肿瘤生长速度差异大：可能是因为注射器吸取细胞悬液前没有充分混匀细胞悬液，导致每只小鼠实际注射的细胞数量不一致；
2. 第 7 天没有看到黑色素瘤硬块：由于每个实验室细胞来源不同、状态不同，可能生长特性会有差异，因此可以调整注射的细胞数目或延长观察时间；
3. 分离肿瘤发现肿瘤内部呈黑色液体状：B16F10 黑色素瘤质地较柔软，切开后有大量黑色糊状组织是正常现象。
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