文献解读｜肿瘤异质性研究策略文献集锦（上）

前 言

肿瘤异质性（ITH）是恶性肿瘤的特征之一，是指肿瘤在生长过程中，经过多次分裂增殖，其子细胞呈现出分子生物学或基因方面的改变，从而使肿瘤的生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性、预后等各方面产生差异。肿瘤异质性也是历年来肿瘤研究领域的热点。

肿瘤内异质性包含两个维度，空间异质性（同一肿瘤不同的区域）与时间异质性（原发性肿瘤与继发性肿瘤）。肿瘤异质性产生的本质在于 “外因”（环境）和“内因”（基因）的双重作用。肿瘤异质性研究的主流方法有三种：第一种是针对肿瘤组织多位点取样，然后利用多组学技术进行检测，代表性技术有外显子测序、转录组测序、单细胞测序；第二种是针对肿瘤组织单点取样测序，利用生物信息学算法量化突变克隆的多样性；第三种是利用空间原位杂交技术进行直接测序，代表性技术有Nanostring DSP 转录组/蛋白质组检测。三种方式都可以结合时间维度进行肿瘤异质性空间和时间上双层次探索。

1、多位点取样，多组学检测

Clinical Cancer Research（IF=12.532）发表了多灶肝内胆管细胞癌（ICC）异质性研究，填补了多灶ICC多组学异质性研究的空白，发现了两类预后相关的免疫亚型，以指导患者精准治疗。

研究路线

对16例多灶ICC患者（共取66处病灶）进行了肿瘤异质性和免疫异质性的多组学研究，包括高深度全外显子测序、单细胞及组织转录组测序、甲基化微阵列和多重免疫荧光染色。通过绘制肿瘤进化树及分析克隆基因型，发现多灶ICC患者的不同病灶均属于肝内转移的起源关系。研究团队通过进一步对灶间异质性（ITH）的评估，将患者划分为低ITH组或高ITH组，并在基因组、转录组及甲基化组层面全面比较高ITH组和低ITH组的基因突变、拷贝数变异、转录及甲基化图谱，发现高ITH组的患者促癌通路上的基因突变频率更高、促癌通路的表达水平上调，且这些促癌通路上的基因具有更多的启动子去甲基化，提示高ITH组患者的肿瘤恶性程度要明显高于低ITH组。

此外，相较于基因组、转录组与甲基化组的灶间异质性，研究团队发现多灶ICC的免疫组学特征在同一个病人内部具有较低的异质性。根据免疫组学特征，可以将多灶ICC患者分为两种免疫亚型，分别具有独特的免疫细胞浸润、肿瘤-免疫细胞互作关系和免疫通路富集情况，而且同一病人的多个病灶大多为同一免疫亚型。基于此，研究团队尝试寻找可区分两类免疫亚型的简单分子标志物，结果发现联合CD8B和ICOS的表达水平可进行免疫亚型的分类，并有效预测患者的预后及免疫治疗疗效。最后，研究团队首次发现ICC不同的免疫组学特征可能与免疫通路上的基因启动子甲基化相关。

图1. 肿瘤异质性ITH不同分组下的基因突变和免疫细胞占比分布情况

综上，该研究首次系统阐明了多灶ICC在多组学上的异质性，药物靶点和免疫微环境在灶间的异质性，解释了ICC靶向治疗与免疫治疗的疗效。并首次建立了有效简易的免疫分型系统辅助ICC患者预后分层和免疫治疗疗效预测，对ICC精准诊疗、识别免疫治疗潜在获益人群具有重要价值。

2

Gut (IF=23.059)发表了多灶肝细胞癌(HCC)异质性研究，填补了多灶HCC多组学异质性研究的空白，发现了三类预后相关的免疫亚型，以指导患者精准治疗。

研究路线

对8例HCC病人进行多点取样，共取42处肝细胞癌组织，利用外显子测序、转录组测序、蛋白质组/代谢组学检测和CyTOF单细胞分析等手段对肝细胞癌的异质性展开研究。首先针对基因组、转录组和蛋白质进行了突变率评价，发现从肿瘤形状来看，不同患者、不同损伤以及同个瘤体不同部位间的外观差异都比较明显。研究者从基因组维度，构建了驱动突变和肿瘤病理进化关系树，发现驱动突变基因明显与肿瘤的病理学以及肿瘤进化途径相关。从转录组维度，通过对不同损伤部位的差异基因进行KEGG信号通路富集分析，发现这些损伤部位的主要差异表达RNA所参与的细胞功能不同。同时也在蛋白组数据中得到了验证，蛋白水平上的差异性小于转录组的差异性。在代谢组的功能富集分析却显示损伤间差异较大，这意味着针对代谢产物设计抗肿瘤药物比较困难。肿瘤的免疫微环境与代谢组的关联较强，而与其他组学的联系较弱。

研究团队利用CyTOF技术对HCC的免疫微环境异质性进行了分析，HCC样本与正常组织样本的免疫微环境差异显著，而8个HCC患者之间的差异也很大。通过差异基因表达聚类分析，获得了3个免疫细胞组成差异较大的亚型。其中，亚型1被划分为免疫能力型，表现为具有正常的T细胞浸润水平，较差的B细胞浸润水平；亚型2被划分为免疫缺陷型，具有较低的淋巴细胞浸润，较高的树突细胞与NK细胞；亚型3被划分为免疫抑制型，表现为Treg、Breg以及M2极化巨噬细胞较多。并且作者在独立的临床队列里也验证了免疫分型与患者预后显著相关，以此证明临床的可操作性和临床价值。

图2. 8例HCC患者DNA水平上肿瘤异质性和与预后相关的三种免疫分型

综上，该研究在基因组、转录组、蛋白组、代谢组层面阐述了HCC肿瘤异质性，并且发现HCC的免疫微环境异质性相对较低，提出针对免疫微环境进行临床治疗方案的设计或许是一个很好的途径。根据免疫组分与免疫功能，作者将HCC分为三个亚型。这些亚型有着独特的代谢特征与细胞因子表达，且与患者的预后显著相关，或可以为临床治疗策略的选择提供理论依据。

多位点取样，多组学层面上解析肿瘤异质性已经成为肿瘤异质性研究的常规思路，但是实际临床研究中，考虑到有些肿瘤发生部位难以获取或获取量非常少，很难满足多组学的检测和分析，另外，多位点取样对患者创伤也很大，实际操作很难实现。针对实际临床研究的难点、痛点，研究者运用模拟算法，优化实验技术等一系列的方法进行了改进。

3、单点取样，算法优化：基因组层面上的肿瘤异质性研究

Molecular Cancer（IF=27.401）发表了“ITH是影响肿瘤免疫检查点抑制剂治疗疗效的重要因素”的相关研究，可作为肿瘤突变负荷（TMB）的有效补充。

ITH计算方法主要通过多点取样的方式，综合评估各个取样位点的基因突变情况，进而计算出患者整体的 ITH 程度。张力教授团队曾在 2019 年 Molecular Cancer 上发表了一项肺癌 ITH 研究，通过多点取样获得了32 例肺癌患者的 181 个不同区域的病灶，经测序分析后发现携带 EGFR 突变的肺癌患者具有更高的 ITH index，据此认为ITH 可能是导致 EGFR 突变肺癌患者整体免疫治疗响应较差的原因之一。然而这种多点取样计算 ITH 方法的可行性较差，很难在实际临床上应用和推广。

因此，为解决这一临床上的难题，张力教授和方文峰教授团队联合了裕策生物，对 ITH 的算法进行优化：通过基因的突变频率，拷贝数和杂合性缺失信息，估算出肿瘤中不同突变频率模式的细胞群体，区分出主克隆和亚克隆后计算整体的 ITH，并尝试使用单次取样的整体 ITH 来代表整个肿瘤组织多点取样的 ITH。结果显示，基于新算法计算的整体单次取样 ITH在很大程度上可代表多点取样的 ITH，并且与患者多点取样 ITH 中位值高度相关，系数达 0.96，说明了使用该算法计算 ITH 具有相当高的可靠性。解决了这个问题后，研究团队便能在更多的队列中探究 ITH 对免疫治疗响应的影响。进一步发现，ITH 是潜在的免疫治疗生物标志物，可预测晚期 NSCLC 患者的疗效，甚至可以预测其他癌种患者接受 ICIs 治疗的疗效。它在低 TMB 人群中的表现最为突出，提示 ITH 和 TMB 的综合评估可进一步扩大 ICIs 治疗优势人群。更可喜的是，ITH 不仅适用于不同癌种，而且在肿瘤组织和外周血（ctDNA）中也能有所表现，并且不限于检测的方式（WES 或 panel 均可），这种通用性和兼容性展现出 ITH 作为免疫治疗 biomarker 的潜在临床应用优势。

图3. 单点取样和多点取样ITH相关性以及ITH影响肿瘤ICIs治疗疗效

参考文献：

1. Chen S, Xie Y, Cai Y, Hu H, He M, Liu L, Liao C, Wang Y, Wang J, Ren X, Zeng Q, Peng H, Shen S, Li S, Li D, Lai J, Peng B, Ren J, Kuang M, Peng S. Multiomic Analysis Reveals Comprehensive Tumor Heterogeneity and Distinct Immune Subtypes in Multifocal Intrahepatic Cholangiocarcinoma. Clin Cancer Res. 2022 May 2;28(9):1896-1910. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-21-1157. PMID: 34526363.

2. Zhang Q, Lou Y, Yang J, Wang J, Feng J, Zhao Y, Wang L, et al. Integrated multiomic analysis reveals comprehensive tumour heterogeneity and novel immunophenotypic classification in hepatocellular carcinomas. Gut. 2019

3. Fang W, Jin H, Zhou H, Hong S, Ma Y, Zhang Y, Su X, Chen L, Yang Y, Xu S, Liao Y, He Y, Zhao H, Huang Y, Gao Z, Zhang L. Intratumoral heterogeneity as a predictive biomarker in anti-PD-(L)1 therapies for non-small cell lung cancer. Mol Cancer. 2021 Feb 23;20(1):37. doi: 10.1186/s12943-021-01331-9. PMID: 33622313; PMCID: PMC7901210.