整合多组学分析肿瘤预后分子亚型
今天和大家分享的是一篇于2021年4月在nature communication上发表的整合转录组，基因组，蛋白组学分析构建非肌层浸润性膀胱癌预后分子亚型的文章"An integrated multi-omics analysis identifies prognostic molecular subtypes of non-muscle-invasive bladder cancer"，作者并开发了一种单一样本分类工具，具体是怎么实现的呢，一起来学习一下吧。
一、数据来源
1、内部UROMOL队列：先前438个肿瘤的RNA-Seq数据与97个肿瘤的新RNA-Seq数据；转录组，基因组，蛋白组学分析数据都源自于此队列
2、外部验证队列：来自GEO或ArrayExpress的11个历史队列的转录组学数据和三个尚未公布的队列的数据
二、摘要
非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)的分子结构具有很大的生物学异质性和不同的临床结果。作者对诊断为NMIBC的患者(n = 834)进行了综合多组学分析。转录组分析确定了反映肿瘤生物学和疾病侵袭性的四类(1,2a, 2b和3)。基于转录组的亚型和染色体不稳定性水平都提供了超出既定预后临床病理参数的独立预后价值。染色体高度不稳定性、p53通路中断和APOBEC相关突变与转录2a类和预后不良显著相关。RNA驱动的免疫细胞浸润与染色体不稳定肿瘤相关，富集于2b类。空间蛋白质组学分析证实了2b类肿瘤的高浸润，并证明了较高的免疫细胞浸润与较低的复发率之间的联系。最后，使用单一样本工具在1228个验证样本中记录了转录组分类的独立预后价值。该分类器为生物标记物的发现和在下一代临床试验中优化治疗和监测提供了一个框架。
三、结果简述
1、NMIBC转录组分类划定
作者首先分析了535例患者RNA-Seq数据（397Ta，135 T1，3 CIS），基于基因表达值变化最大的4000个基因，使用无监督共识聚类分析确定了患者的四个转录组分类(1，2a， 2b和3)。与之前的URMOL2016 类别部分重叠。两类显示了显著不同的无进展生存期和无复发生存期(图1c，d).转录组分类与各种临床病理参数显著相关(图1e)。NMIBC分类相关的生物学过程分析揭示了从分子分类和结果中鉴别经典组织学特征的重要信息。1类和3类肿瘤与早期细胞周期基因相关，2b类肿瘤主要与癌症干细胞标记物的表达相关与EMT相关基因但与细胞增殖的相关性较小(图1 f)。
随后作者通过RNA-Seq数据的反褶积来估计免疫细胞的存在。2b类肿瘤的总免疫浸润评分显著高于所有其他类肿瘤，表明免疫细胞浸润水平较高(图1g)。3类肿瘤的免疫浸润评分明显低于1类和2a类。利用与不同治疗策略潜在相关性的基因签名对这四类进行了表征(图1f，g)。与所有其他类肿瘤相比，2b类肿瘤的免疫检查点标记物和其他免疫相关标记物的表达显著更高，这表明这类肿瘤可能对免疫治疗更有反应。
为了进一步探索NMIBC类之间的转录组差异，作者分析了一个预先定义的23个转录因子列表(即调控因子)，这些转录因子之前对MIBC33和与癌症中染色质重塑相关的候选调控因子进行了研究。这一分析证实了四种亚型分类的生物学相关性，因为调控活性与转录组类高度相关(图1 h, i)。
Fig. 1 Transcriptomic classes in NMIBC
2、染色体不稳定与高危NMIBC有关
为了进一步研究NMIBC的基因组异质性，作者使用Illumina SNP阵列分析了473对肿瘤-白细胞样本。根据CNA负荷的增加，肿瘤样本分为3个数量相同的基因组类(GC1-3)，代表低、中、高三种染色体不稳定性情况(图2a)。作者观察到53%的9号染色体部分或完全丢失，并且22%的肿瘤的8q22.1扩增。基因组类与PFS和RFS显著相关(图2 b, c)。重要的是, 将生存分析局限于EORTC风险评分高的肿瘤(> 6)，基因组分类仍与PFS显著相关(图2d)。基因组分类与分期、分级、伴随CIS和EORTC风险评分显著相关(图2a)。多变量Cox回归分析表明，在校正肿瘤分期和分级以及EORTC风险评分后，基因组分类是进展的独立预后变量。
Fig. 2 Copy number alterations in NMIBC
3、基因组和转录组数据整合分析分类
对303个肿瘤的基因组和转录组数据的综合分析表明，转录组分类与基因组分类显著相关(图3 a)。2a类包括GC3中肿瘤的最高比例。2a类和2b类有较高的进展评分(图3 b)。仅分析2a类和2b类肿瘤时，基因组类仍与PFS显著相关;所有进展事件与GC3肿瘤相关(图3 c)。
具有中等或高功能影响的单核苷酸变异(SNVs)是根据RNA-Seq数据命名的。与所有其他类型的肿瘤相比，2a类肿瘤显示出显著更高的SNVs数量(图3 d)。列出了膀胱癌中选择的常见突变基因，疾病驱动基因的拷贝数改变(来自SNP微阵列分析)被强调用于比较，并表明CDKN2A总体缺失，2a类中PPARG和E2F3显著增加，2a类中RB1缺失(图3e)。与DNA测序相比，基于RNA-Seq数据的突变调用有几个局限性，如果没有参考种系比较，则有可能在分析中包括种系变异。作者比较了38名患者的肿瘤和生殖系的RNA-Seq和全外显子组测序(WES)，发现每个样本和跨样本应用的过滤方法显著富集了我们提出的基因列表中的体细胞SNV(图3f)，这表明潜在的生殖系变异对后续分析的影响有限。
此外，图3g显示了与转录组类显著相关的基因组改变的概述。值得注意的是，在42%的肿瘤中观察到p53通路改变(MDM2、E2F3、TP53、ATM和RB1为p53通路中关键分子)(图3h)，与高CNA负担显著相关(图3i)和2a类肿瘤。DNA损伤修复(DDR)基因突变与RNA衍生的突变负荷显著相关(图3 j)。此外，作者发现GC3肿瘤中突变负荷和免疫细胞浸润(基于RNA-Seq)显著增加(图3k, l)。作者推断以及4个特征显示与先前在膀胱癌中发现的特征高度相关:SBS1(与年龄相关)、SBS2和SBS13(与APOBEC过度活性相关)和SBS5(与ERCC2突变相关(图3e)。2a类肿瘤在APOBEC相关签名的背景下有更多的突变(图3m)。
Fig. 3 Genomic alterations associated with transcriptomic classes
4、肿瘤和免疫细胞环境的空间蛋白质组学分析
为了在空间水平上解决上述免疫特征，对167个肿瘤进行了多重免疫荧光(mIF)和免疫组化(IHC)分析。应用自动图像分析算法研究免疫细胞的空间组织和免疫逃逸机制(图4a)。以150个肿瘤的RNA-Seq数据为基础的RNA来源的免疫评分与肿瘤实质中浸润性免疫细胞水平显著相关(图4 b)。具有高免疫浸润的肿瘤显示了MHC I类的高表达。只有少数肿瘤在肿瘤实质中表达PD-L1，大多数肿瘤为高度炎症(图4 b)。
在蛋白质组水平鉴定出的浸润性免疫细胞水平与转录组分类显著相关，2b类肿瘤的免疫浸润最高(图4c)，支持转录组反褶积分析描述的观察结果。
尽管炎症性2b类肿瘤具有总体侵袭性特征，但高免疫浸润与较低的复发率显著相关(图4d)。进展事件太少，不足以证明这对PFS的影响。此外，在具有相似基因组背景的肿瘤患者(少数基因组改变)中可能出现保护性免疫反应;在本组中，免疫细胞浸润高的患者比免疫细胞浸润低的患者有更长的RFS (图4 e)。
对基础细胞角蛋白表达(CK5/6)和管腔特征(GATA3)进行染色，并将其与癌细胞的泛细胞角蛋白染色进行对齐，以估计CK5/6、GATA3或两者均阳性的癌细胞比例。CK5/6阳性细胞的比例与转录组分类相关，第3类具有最强的CK5/6表达富集(图4 f)。
Fig. 4 Spatial proteomics analysis of tumor immune contexture Copy number alterations in NMIBC
5、综合预测模型、分类器构建和独立验证
图5a显示了对选定的临床特征和分子变量的单变量Cox回归分析的概述。使用logistic回归模型(图5b)进行了预测5年内病情进展的受试者工作特征(ROC)分析。将EORTC风险评分与基因组分类相结合，预测准确率从0.77提高到0.82，将EORTC风险评分与转录组分类相结合，预测准确率提高到0.85。将所有三个变量纳入模型后，预测精度略微提高至0.88。
总的来说，每个转录组类都有不同的临床特征、分子特征和肿瘤微环境(图5c)。为了便于在未来的研究和临床环境中使用这四种转录组分类，作者为NMIBC构建了一个单样本分类器。将分类器应用于14个独立的队列，包括3个未发表的数据集，共1228例患者，他们的肿瘤在不同的平台上进行分析(图6a)，发现肿瘤级别与肿瘤分期、肿瘤级别与FGFR3和TP53突变之间存在高度显著的相关性(图6b)，且分级显示了显著不同的PFS (图6c) 2a级肿瘤患者预后最差。为了进一步验证UROMOL2021分类器，作者比较了发现队列和独立队列中不同类别的调节活性和生物通路富集的差异。调节子和路径分析证明了数据集之间的高度一致性(图6d, e)，支持了分类的稳健性。
Fig. 5 Prediction models and summary characteristics of classes
Fig. 6 Validation of transcriptomic classes in independent cohorts
四、小结
作者报告了一项对纳入UROMOL项目的834例NMIBC肿瘤的综合多组学分析，从转录组切入整合基因组，蛋白组进行分类。基于详细、高质量的临床数据，描述了与疾病侵袭性相关的生物学过程，并提供并验证了一种分类工具，用于将转录组分类和相关进展风险分配给独立样本。疾病生物学的转录组分类为下一代临床试验中的生物标志物发现提供了一个框架，以优化当前NMIBC患者的临床管理。
原文转自：医学僧的科研日记(ID:zzudoctor)
