快报 | 结核潜伏感染预防性疫苗PP19128R的构建及其免疫学特性初步分析

作者：江帆 彭聪 程鹏 王杰 连建奇 龚文平

第一作者及单位：江帆，解放军总医院第八医学中心结核病医学部研究所/空军军医大学基础医学院学员二大队；彭聪，解放军总医院第八医学中心结核病医学部研究所。

通信作者及单位：龚文平，解放军总医院第八医学中心结核病医学部研究所

PP19128R, a Multiepitope Vaccine Designed to Prevent Latent Tuberculosis Infection, Induced Immune Responses In Silico and In Vitro Assays

Vaccines (Basel). 2023 Apr 17；11(4):856.

doi:10.3390/vaccines11040856.

PMID:37112768.

研究背景

   结核病(TB)是由结核分枝杆菌(MTB)感染引起的一种传染病。卡介苗(BCG)是唯一广泛用于预防结核病的疫苗，但BCG在预防成人结核病的效力方面表现出高度异质性。因此，为了开发保护效果更好的TB疫苗，在过去的几十年中，新型结核病疫苗得到了积极的开发，如灭活、减毒活疫苗、亚单位和病毒载体结核病疫苗。最新的临床试验结果表明，一度被人们寄予厚望的明星TB亚单位疫苗M72/AS01E仅显示49.7% (95%CI：2.1～ 74.2)的效力。

   结核分枝杆菌潜伏感染(LTBI)被定义为“对MTB抗原刺激的一种持续免疫应答状态，无临床表现活动性结核的证据”和“指的是没有结核病的情况下具有结核免疫反应性的宿主”。之前的一项研究报道，2014年全球LTBI患病率为23.0%，LTBI患者已成为活动性结核病(ATB)患者的重要来源。然而，目前尚无预防LTBI的特异性疫苗。传统疫苗的开发是一个极其漫长的过程。随着计算机信息技术、人工智能和机器学习的出现，生物信息学和免疫信息学方法逐渐发展，推动基于反向疫苗学的多表位疫苗(multiepitope vaccines, MEVs)发展进入快车道。

   在这项研究中，笔者的目标是开发一种新型的MEV，用于预防潜伏感染。本研究为预防LTBI提供了一种新的潜在候选疫苗，并为评估MEV在计算机模拟分析和体外实验之间的一致性提供了一种方法。

研究结果

一、HTL、CTL和B细胞免疫优势表位的鉴定和人群覆盖度分析

   使用17种LTBI-RD抗原来鉴定HTL、CTL和B细胞免疫优势表位，结果显示鉴定出19个HTL、12个CTL和8个B细胞免疫优势表位，通过这些表位构建了一个MEV，命名为PP19128R。然后使用IEDB数据库对这些免疫优势的HTL和CTL表位的人群覆盖度进行了分析。观察到在东亚、南亚、东南亚、西南亚、东北亚、中非、东非、北非、西非、南美洲、北美洲、欧洲和大洋洲以及全球范围内，HLA-I等位基因（限制CTL表位）的人群覆盖度分别为85.63%、70.59%、91.15%、64.29%、92.53%、57.38%、61.10%、65.52%、59.42%、65.56%、82.17%、82.00%、76.33%和82.24%。同样地，笔者发现在东亚、南亚、东南亚、西南亚、东北亚、中非、东非、北非、西非、南美洲、北美洲、欧洲和大洋洲以及全球范围内，HLA-II等位基因（限制HTL表位）的人群覆盖度分别为73.85%、97.75%、88.86%、83.80%、97.97%、82.75%、89.22%、80.01%、88.35%、98.12%、99.93%、99.06%、97.55%和93.71%。

二、PP19128R疫苗的构建和理化性质和二级/三级结构的预测

   结果显示，PP18128R疫苗包含19个HTL、12个CTL和8个B细胞免疫优势表位，并分别使用GPGPG、AAY和KK连接肽连接在一起。此外，还添加了PorB、PADRE和RS-09来提高疫苗的免疫原性（图1A）。PP18128R疫苗由930个氨基酸组成，理论分子量为98557.86 Da（图1B）。PP19128R疫苗的二级结构分析显示，它包含39.46％的α螺旋，11.61％的扩展链和48.92％的随机卷曲（图1C）。此外，Expasy Protparam服务器的结果显示，PP19128R疫苗具有理论等电点为9.20；在哺乳动物网织红细胞中的半衰期为20小时，在酵母菌中为30分钟，在大肠杆菌中为10小时；不稳定指数为33.20；脂肪族指数为79.32；大均值的疏水性（GRAVY）为0.04；溶解度为0.900675。

图1 PP19128R疫苗构建策略及二级结构示意图

   使用ProSA Web服务器和UCLA-DOE LAB SAVES v6.0来验证PP19128R疫苗的三维模型。结果显示，PP19128R疫苗在优化前和优化后的Z得分分别为-5.59（图2A）和-6.28（图2B）。此外，Ramachandran图表明，PP19128R疫苗的候选模型包含70.8％的核心区域，22.8％的允许区域，4.4％的一般区域和2.0％的不允许区域（图2C）。有趣的是，在优化后，这些数据发生了改变，变为87.2％的核心区域，9.0％的允许区域，1.6％的一般区域和2.2％的不允许区域（图2D）。此外，PP19128R疫苗中氨基酸残基的最大偏差比例从23.2％降低到18.8％。

   此外，I-TASSER服务器生成了五个3D模型，它们的C得分分别为-1.39、-3.27、-3.98、-4.26和-4.37，通常在-2至5之间。得分越高，模型越准确。因此，选择模型一（C得分= -1.39，估计TM得分= 0.54 ± 0.15，估计RMSD= 12.1 ± 4.4 Å）进行进一步分析（图2E）。随后，Galaxy Refine Web服务器根据GDT-HA、RMSD、MolProbity、Clash score、Poor rotamers和Rama favored score对疫苗模型进行了优化。最终，选择具有最高GDT-HA值、最低MolProbity值和最高Rama favored score的模型五作为PP19128R疫苗的最终3D模型（图2E）。

图2 PP19128R疫苗三维模型的构建与优化

三、PP19128R疫苗与TLR2和TLR4分子对接

   使用ClusPro2.0服务器进行PP19128R疫苗和TLRs的分子对接，生成30个模型复合物。分析这些模型复合物的结合能，确定了具有最低结合能的最佳PP19128R-TLR2复合物。发现PP19128R-TLR2复合物的结合能为-1324.77kcal/mol（图3A）。此外，笔者还探索了PP19128R疫苗和TLR2之间的潜在结合位点，发现有17个结合位点通过氢键连接PP19128R疫苗和TLR2（图3B）。类似地，选择结合能最低的PP19128R-TLR4复合物中的一个模型进行进一步分析。PP19128R-TLR4复合物的结合能为-1278kcal/mol（图4A），PP19128R疫苗和TLR4之间有10个结合位点通过氢键连接（图4B）。

图3 PP19128R疫苗与TLR2的分子对接和结合位点分析

图4 PP19128R疫苗与TLR4的分子对接和结合位点分析

四、PP19128R疫苗在体内诱导了强有力的免疫应答

   特异性和非特异性免疫应答在宿主清除结核分枝杆菌过程中都发挥着重要作用。因此，C-IMMSIM服务器预测了PP19128R疫苗诱导的NK细胞、巨噬细胞、B细胞、CD4⁺T细胞（Th1和Th2细胞）以及CD8⁺T细胞（CTLs）的激活（图5）。

图5 在模拟状态下PP19128R疫苗诱导的固有免疫细胞群变化

   此外，笔者分析了PP19128R疫苗诱导的模拟适应性免疫应答。结果表明，PP19128R疫苗的免疫模拟诱导了记忆性HTLs数量的3个峰值，特别是在第3次免疫后，数量增加了多达12,000个细胞/每毫升（图6A）。另外，笔者还发现，PP19128R注射可刺激活性HTLs的数量在第一次免疫后的20、40和75天出现了3个峰值（图6B）。然而，与HTLs相比，PP19128R疫苗刺激免疫系统产生记忆性CTLs的能力较弱（图6C），活性CTLs在第1次免疫后的50天达到峰值，然后逐渐减少，而静止的细胞毒性T淋巴细胞则呈相反的趋势（图6D）。有趣的是，笔者发现PP19128R疫苗诱导T淋巴细胞向Th1型淋巴细胞分化，并介导了强有力的Th1型免疫应答（图6E）。此外，笔者还观察到PP19128R疫苗可以诱导调节性T细胞迅速达到峰值，然后逐渐下降（图6F）。最后，笔者还分析了PP19128R疫苗诱导免疫细胞产生IFN-γ的能力。笔者发现，使用PP19128R进行3次免疫可以诱导细胞因子IFN-γ和IL-2形成3个峰值（图7）。

图6 在模拟状态下PP19128R疫苗诱导的适应性免疫细胞群变化

图7 PP19128R疫苗在模拟状态下诱导的细胞因子

五、PP19128R疫苗在体外诱导了显著更高水平的免疫应答

   笔者成功在体外表达了PP19128R疫苗分子，其分子量为98.57 kDa。为了验证PP19128R疫苗的免疫特征在体外和体内的相关性和一致性，笔者在健康志愿者、患有LTBI和ATB病人的PBMCs中加入PP19128R疫苗进行体外实验。作为阳性对照，笔者使用了笔者之前开发的结核疫苗HP13138PB。此外，笔者使用ELISPOT和CBA检测其免疫原性。结果显示，在健康志愿者（图8A）、ATB病人（图8B）和LTBI个体（图8C）中，PP19128R疫苗引起的IFN-γ⁺T淋巴细胞数量比AIM或HP13138PB疫苗更高。此外，尽管PP19128R疫苗引起的IFN-γ⁺T淋巴细胞数量与阴性对照（AIM）和阳性对照（HP13138PB疫苗）引起的数量没有统计学上的差异，笔者观察到PP19128R组中IFN-γ⁺T淋巴细胞数量在健康志愿者、ATB和LTBI组中均高于阴性和阳性对照组。这些结果表明PP19128R疫苗在人群中具有广泛的免疫原性。

图8 PP19128R特异性IFN-γ⁺ T淋巴细胞的数量

   此外，笔者还在体外评估了PP19128R疫苗诱导产生细胞因子（如IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10和IL-17A）的能力。结果显示：(1) PP19128R疫苗可以诱导HCs (P＜0.0001) 和ATB患者 (P = 0.0039)的PBMCs分泌TNF-α水平明显高于AIM培养在HCs的水平 (图9A)；(2) PP19128R疫苗在HCs中诱导的IFN-γ水平（P = 0.0019）显着高于AIM培养基在HCs中诱导的水平(图9B)；(3)PP19128R疫苗在HCs (P = 0.0003)、ATB患者(P=0.0009)和LTBI个人(P=0.0386)中诱导的IL-6水平显着高于HCs中AIM培养基诱导的水平(图9C)；(4)PP19128R疫苗在HCs (P=0.0063)、 ATB患者(P=0.0181)和LTBI个人(P=0.0010) 中诱导的IL-10水平显着高于HCs中AIM培养基诱导的水平(图9D)。此外，笔者检测到的IL-2、IL-4和IL-17A的实际浓度（未显示数据）低于CBA试剂盒可以检测到的理论值，因此笔者没有分析这3种细胞因子的浓度。

图9 PP19128R疫苗在LTBI、ATB和HCs3组人群种诱导的细胞因子水平

六、PP19128R疫苗诱导的细胞因子的相关分析和简单线性回归分析

   为了进一步探究PP19128R疫苗诱导的细胞免疫反应的特征，笔者还基于主成分分析和相关分析研究了起重要作用的细胞因子及其之间的相关性。结果显示如下：（1）在健康人群中，PP19128R诱导的细胞因子被聚类为3组 - IFN-γ，IL-6和TNF-α作为一组；IL-10，IL-4和IL-17A作为另一组；而IL-2单独成为一组，但是细胞因子之间没有显著的相关性（图10A）。（2）在ATB患者中，PP19128R诱导的细胞因子同样被聚类为3个家族，与健康对照组类似，TNF-α与IFN-γ（P= 0.024）和IL-6（P= 0.007）呈正相关，IFN-γ与IL-6呈正相关（P= 0.016），IL-10与IL-17A呈正相关（P= 0.035）（图10B）。（3）在LTBI人群中，PP19128R诱导的细胞因子被聚类为两个组 - IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-17A和TNF-α作为一组，而IL-6和IL-10作为另一组 - 并且还发现IL-2与TNF-α（P＜0.0001），IL-4（P= 0.003）或IL-17A（P= 0.015）之间存在正相关性；TNF-α与IL-4（P= 0.009）或IL-17A（P=0.019）之间存在正相关性；IL-10与IL-6之间存在正相关性（P=0.018）（图10C）。

图10 PP19128R诱导的细胞因子的主成分分析(PCA)及相关分析

   针对上述存在相关性的细胞因子，进行了简单的线性回归分析，结果显示：（1）在LTBI受试者中，PP19128R诱导的TNF-α与IL-2之间存在显著正相关（R² = 0.965，P＜0.0001，Y = 0.006311X - 0.1866，图11A），IL-4与IL-2之间存在显著正相关（R² = 0.7855，P= 0.0036，Y = 0.7980X - 1.781，图11B），IL-4与TNF-α之间存在显著正相关（R² = 0.7065，P= 0.0090，Y = 117.8X - 224.6，图11C），IL-6与IL-10之间存在显著正相关（R² = 0.6343，P= 0.0180，Y = 0.01476X - 172.9，图11D），IL-17A与IL-2之间存在显著正相关（R² = 0.6574，P=0.0146，Y = 0.2586X - 0.5414，图11E），以及IL-17A与TNF-α之间存在显著正相关（R² = 0.6302，P= 0.0186，Y = 39.42X - 48.09，图11F）；（2）同样，在PP19128R诱导的IFN-γ和TNF-α之间存在显著正相关（R² = 0.6708，P= 0.0242，Y = 107.7X - 523.7，图12A）、IL-6和TNF-α之间存在显著正相关（R² = 0.7989，P= 0.0067，Y = 0.1831X - 2862，图12B）、IL-6和IFN-γ之间存在显著正相关（R²= 0.6224，P= 0.0350，Y= 7.554X - 7.930，图12C），以及IL-17A和IL-10之间存在显著正相关（R² = 0.7218，P= 0.0155，Y= 0.001323X - 14.71，图12D）这些细胞因子。

图11 LTBI人群细胞因子的简单线性回归分析

图12 ATB人群细胞因子的简单线性回归分析

研究结论

   综上所述，本研究开发了一种有前途的LTBI多表位疫苗PP19128R，其由19个HTL表位、12个CTL表位、8个B细胞表位、TLR激动剂和助剂构成。生物信息学和免疫信息学分析表明，PP19128R疫苗具有出色的抗原特异性、免疫原性、非毒性和不致敏性，且可靶向作用于巨噬细胞上的TLR2和TLR4以激活T和B淋巴细胞产生高水平的细胞因子，尤其是IFN-γ、TGF-β和IL-2。ELISpot和CBA实验结果表明，PP19128R疫苗可以诱导高水平的IFN-γ⁺ T淋巴细胞，并能诱导健康人群、ATB患者和LTBI人群来源的PBMC产生重要细胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-10的分泌。本研究为LTBI的预防提供一种候选疫苗，也为结核疫苗的研发提供了新思路。

   本研究存在如下局限性：（1）PP19128R疫苗的物理化学性质和空间结构分析仅限于计算机模拟，未在现实世界中进行验证；（2）仅通过免疫信息学技术探究了PP19128R疫苗诱导的先天和适应性免疫细胞的亚型，而未通过流式细胞仪进行实际分析；（3）在健康人群、ATB患者和LTBI参与者的外周血单个核细胞进行了PP19128R疫苗的免疫原性验证，但未在动物模型中进行体内实验；（4）未在动物模型中评估PP19128R疫苗的保护功效。

本文来自于“中国防痨杂志期刊社”公众号