protocol 分享｜小鼠骨髓来源中性粒细胞的分离培养

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简介

相比于人类的中性细胞从外周血中大量获取，从血液中分离小鼠中性粒细胞则难度比较大。通过改善传统的腹腔注射巯基乙醇技术，应用 Histopaque 1077 和H istopaque 1119 的密度梯度离心可以获得满足实验要求的较高纯度中性粒细胞。

原理

小鼠骨髓相比于腹腔和血液，是一个巨大的中性粒细胞储存库，中性粒细胞作为先天免疫系统中丰度较高的细胞，参与天然免疫并调节适应性免疫。

用途

骨髓中的中性粒细胞已被证明可以替代血液中的中性细胞，用于培养研究。

材料与仪器

【溶液与试剂】

C57BL/6 小鼠、含 10% FBS 的 1640 培养基、75% 酒精、9% 生理盐水、无菌 PBS、Histopaque 1077、Histopaque 1119

【仪器与耗材】

无菌剪刀、无菌镊子、70 μm细胞过滤器、细胞培养板

步骤

（1）小鼠颈椎脱臼处死，喷洒酒精消毒迅速分离股骨和胫骨，尽可能完全地去除肌肉组织；

（2）将股骨和胫骨收集到预冷 10% FBS 1640 培养基，在冰上进行下游操作；

（3）用无菌 PBS 冲洗三次，9% 的生理盐水浸泡股骨和胫骨，两端剪去，暴露骨髓腔；

（4）生理盐水反复冲洗骨髓腔，70 μm 细胞过滤器过滤骨髓冲洗液；

（5）离心，室温 1200 rpm，5 min，弃上清；

（6）生理盐水重悬，加入 Histopaque 1077 中；

（7）离心，4℃，2000 rpm，20 min；

（8）弃去上层物质，生理盐水重悬，加入到 Histopaque 1119 中；

（9）离心，4℃，2000 rpm，20 min；

（10）小心吸取中间层液体，生理盐水重悬稀释；

（11）轻柔混匀，离心，4℃，1500 rpm，10 min；

（12）弃上清，1640 完全培养基重悬细胞于细胞培养板，CO2 培养箱分离培养。

注意事项

1. 实验前所有器械消毒，高压灭菌，液体无菌过滤；

2. 生理盐水冲洗骨髓腔时，要冲至骨髓腔发白；

3. 用于后续培养需保证全程无菌操作；

4. 生理盐水细胞重悬液与 Histopaque 1077 的体积比为 1:3，加入时需沿管壁缓慢加入；

5. 生理盐水细胞重悬液与 Histopaque 1119 的体积比 1:2，加入时需沿管壁缓慢加入；

6. 云雾状的中间层液体即为中性粒细胞所在，吸取液体与加入生理盐水的体积比为 1:5。

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