内参跑不出来，求助前辈们。
发布于 2023-04-26 · 浏览 697 · IP 河北河北
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实验小白，实验室因为疫情断了，上面也没有师兄师姐带，全程自己摸索，现在跑内参（β-actin）的时候发现一板胶上面有些样本跑不出来（如下图1, 8个样本都是同一批提的，具体样本提取步骤在后面）
而同一板胶上的目的蛋白都出来了（图2）；
1抗和2抗都是新配的。样本都是同一批提的，用均浆器，RIPA裂解，加了PMSF，冰上操作，因为有DNA絮状物就用1ml注射器反复抽吸了10次，再离心（12000r，10min）取上清后分了三管（约100ul 1管），马上放到-80℃里，然后等着这批样本都提完了之后再统一拿1管出来解冻，BCA测浓度后再分装成更小的管（按100ug的体积分装，约7-8ul每管）。跑胶的时候就是一次拿一瓶这种小的管再加RIPA和loading buffer 稀释到50ul，100℃煮5min，一次上样20ul/40ug。
后面我又取了一个大管（约100ul/管）的样本出来跑这一个样本加8个孔，也是每孔20ul/40ug，结果（图3：β-actin，图4：目的蛋白）。
到这里我怀疑是不是有些样本里的β-actin降解了，就把大管（约100ul/管）里的样本和小管（约7-8ul每管）里的样本一起拿出来跑了一板，结果（图5：β-actin，图6：目的蛋白）（图5：1泳道）
所以各位老师们，这是因为小管多冻融了1次导致的β-actin降解了，所以跑不出来吗？
最后编辑于 2023-04-26 · 浏览 697
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