【交流】枯草杆菌感受态转化之体验和心得

这几天又作了一次感受态转化。
转化的对象有：自主复制型穿梭载体，线性化双交换同源重组载体，还有超螺旋双交换同源重组载体。
转化结果是我做了几年来最高的一次了。转化500ul感受态细胞，加入质粒未定量，是从1ml大肠杆菌中提取出来的，估计有几个微克。

自主复制型穿梭载体：涂布了一块平板，250ul转化液，得到598个转化子，全部为目的基因表达的阳性转化子。这个载体是Cm抗性的，在枯草杆菌中应用比较好，一般不会产生抗生素自发突变子。

线性化双交换同源重组载体：众所周知，枯草杆菌对于线性化质粒的转化效率要比超螺旋的高的多很多。但是要得到整合子，必须保证双交换同源重组事件的发生，而这个几率是狂低的，至少小于1/1000000的。所以，我得到的转化子也比较少：250ul转化液只有50-100个左右。质粒是spc抗性的，枯草容易产生自发突变抗性，经检验大多数都是假阳性的。据我所试，卡那霉素也是如此的，所以各位做枯草的朋友最好用Cm。

超螺旋双交换同源重组载体：超螺旋的转化效率低一些，但是只要发生单交换就可以获得整合子，这块平板竟然在48h后得到每板1500-2500左右的转化子。我狂惊！里面不乏也有自发突变的假阳性。随便挑了6个，4个是真的。

总结：枯草杆菌的试验总会碰到一些莫名其妙的事情。比如我做转化，发现24h长出来的转化子基本就都是假的，也就是说自发突变的获得抗性的菌长得快。有的文献说要培养平板36-48h看来不无道理，24h和48h的转化子数有的时候有天壤之别。枯草的自发突变最让人头疼，因为你总要从那些滥竽充数的家伙中去寻找你的宝贝。枯草杆菌作表达的时候质粒容易缺失插入片断而导致结构上的不稳定，这种情况我也碰到过了。

祝各位好运，欢迎交流心得，共同讨论！