电转化枯草芽孢杆菌

电转后一直长不出菌落，不知道问题在哪？求教！！！

 B. subtilis WB600 感受态制备及重组质粒的电转化

试剂： GM：LB + 0.5 M 山梨醇

ETM： 0.5 M 山梨醇+ 0.5 M 甘露醇+ 10%（体积比）甘油

RM：  LB + 0.5 M 山梨醇+ 0.38 M 甘露醇

方法：

（1）将保存于-40℃冰箱里的 B. subtilis WB600 划线于 LB 平板上，37℃倒置培养 24 h。

（2）新鲜平板上挑取单菌落（一小点为好）接种于 3 mL LB 培养基中，过夜培养。

（3）取 2.6 mL 过夜培养物接入 40 mL GM 培养基中，37℃，200 rpm 培养至 OD600 = 0.85-0.95（大约 3-4 h）。

（4）将培养液倒入 50 mL 冰上预冷的无菌离心管中放冰上冷却 10 min，然后于冷冻离心机 4℃，5000 rpm 的条件下离心 5 min，倒掉上清液收集菌体细胞。

（5）在超净工作台中将 40 mL 事先放冰上冷却过的电转培养基 ETM 倒入离心管中颠倒数次以使菌体细胞重新悬浮，然后于冷冻离心机中 4℃，5000 rpm 的条件下离心 5 min后回超净台中倒掉上清液，这样重复 4 次对菌体细胞进行洗涤。

 （6）洗涤完成后每个离心管中加入 1 mL 电转培养基 ETM 并用枪吹打混匀后分装到1.5 mL 的 EP 管中，每管分装 60 μL 以备后续转化所用。

（7）将新分装好的感受态放冰上，每管感受态细胞中加入 1 μL（约 50 ng/μL）的重组质粒，吸打混匀后于冰上冷却 2 min，然后加入到事先放冰上冷却过的 1 mm 电转杯中进行电击，电击条件设定为 25 μF，200 Ω，4.5-5.0 ms，12.5 kV/cm。

（8）电击完毕取出杯子立即加入 1 mL RM，37℃，200 rpm，复苏 3 h 后涂布在含卡那霉素的 LB 平板上，37℃过夜培养，待长出转化子后进行验证。