长春兽医研究所团队在新冠疫苗开发上取得新进展

新冠（COVID-19）大流行已持续三年，全球感染病例超过6.7亿例，死亡病例超过670万例。世界卫生组织在不久前宣布，尽管新冠大流行可能正接近转折点，但仍然构成“国际关注的突发公共卫生事件”。因此，目前迫切需要一种有效的疫苗来预防新冠病毒（SARS-CoV-2）。

近日，中国农业科学院长春兽医研究所团队在新冠疫苗开发上取得新进展。他们在《International Journal of Molecular Sciences》杂志上发表论文，强调了S蛋白RBD三聚体在新冠疫苗开发中的重要性，并为开发针对RBD结构域的保护性疫苗提供了理论依据。

来源：《International Journal of Molecular Sciences》

研究材料与方法

研究人员选择了杆状病毒表达系统来表达重组的RBD蛋白三聚体。在纯化和鉴定蛋白后在hACE2人源化小鼠（赛业生物提供）上开展了动物免疫接种实验，并通过ELISA分析评估了SARS-CoV-2特异性抗体的水平。随后用病毒感染的hACE2小鼠评估RBD-6HB疫苗的保护作用，作者通过RT-qPCR方法检测了病毒载量，并开展了组织学分析。

技术路线

1.设计和构建表达RBD-6HB的重组杆状病毒

2.对RBD-6HB重组蛋白进行表达、纯化和鉴定

3.在hACE2小鼠上评估RBD-6HB疫苗的免疫原性

4.评估RBD-6HB疫苗对hACE2小鼠的保护作用

研究结果

1.RBD-6HB重组蛋白的构建和表达

众所周知，新冠病毒进入细胞是由S（刺突）蛋白介导的，S蛋白自组装成同源三聚体，在病毒表面形成特殊的花冠结构。S蛋白上的受体结合结构域（RBD）与宿主细胞的ACE2受体结合，因此可作为开发中和抗体的主要目标。

研究人员推测，与原生结构相似的三聚体可能会增加RBD的免疫原性，因此，他们将六螺旋束（6HB）添加到RBD蛋白的C端，使其形成稳定的三聚体结构。6HB是一种热稳定的三聚体结构域，来源于HIV的gp41蛋白，在此作为“分子钳”以增加病毒蛋白的稳定性。他们选择杆状病毒系统来表达去糖基化的RBD蛋白（RBDΔN1）与6HB的融合体，因为去除糖基化位点可增加蛋白表达，并维持其抗原性和功能。

图1 三种重组杆状病毒的示意图[1]

重组杆状病毒rBV-SARS-CoV2-RBD-6HB以及对照（RBD和6HB）的构建过程如图1所示。研究人员用重组杆状病毒感染sf9细胞后，开展Western blot分析，发现RBD-6HB蛋白在感染的细胞中有效表达。他们在收集培养上清液后进行蛋白纯化，获得了纯度高达97%的蛋白质。他们还发现，RBD-6HB蛋白能够形成三聚体（分子量约为120 kDa），这一点通过SDS-PAGE和Western blot得到了验证。

2.RBD-6HB疫苗对小鼠的完全保护

之后，研究人员在hACE2人源化小鼠上评估了RBD-6HB三聚体的免疫原性，这种稳定表达人类ACE2受体的人源化ACE2小鼠是由赛业生物构建的。他们将6周龄的hACE2小鼠随机分为三组，将指定的蛋白和佐剂注射到小鼠体内。加强免疫后，他们发现RBD-6HB在氢氧化铝和CPG佐剂存在的情况下能够刺激小鼠持续产生高水平的抗体，且RBD-6HB组的抗体滴度高于RBD组（图2）。同时，与对照组相比，疫苗组小鼠的食量和活动情况无明显差异，表明疫苗的刺激性较小。

图2 在小鼠中接种疫苗后的血清抗体反应[1]

最后，研究人员还评估了RBD-6HB疫苗对小鼠的保护作用。他们将新冠病毒注射到hACE2小鼠体内。根据qPCR检测的结果，RBD-6HB+佐剂组中SARS-CoV-2的N基因表达量比6HB组低100倍，比RBD+佐剂组低50倍，这表明候选疫苗具有中和病毒的作用。同样地，RBD-6HB+佐剂组中SARS-CoV-2的E基因表达量也低于对照组，表明候选疫苗可能具有抑制病毒体内复制的作用。

组织学分析显示，RBD-6HB组小鼠的肺组织表面被覆一层光滑的浆膜，显示完整的肺泡结构，无明显异常，而对照组则存在炎症细胞浸润，血管充血和肺泡扩张（图3）。这些结果表明，RBD-6HB疫苗能够建立有效的保护屏障，帮助小鼠抵御新冠病毒感染。

图3 RBD-6HB疫苗对hACE2小鼠的保护[1]

研究结论

综上所述，三聚体结构的RBD-6HB蛋白在佐剂存在的情况下能够诱导机体产生特异性抗体。RBD-6HB疫苗对hACE2小鼠具有保护作用，有效降低了肺部的病毒载量，减少了炎性组织损伤。这项研究突出了RBD结构域在新冠疫苗设计中的重要性，为保护性疫苗的开发提供了理论基础。

原文检索：

[1] Qu Q, Hao P, Xu W, Li L, Jiang Y, Xu Z, Chen J, Gao Z, Pang Z, Jin N, Li C. A Vaccine of SARS-CoV-2 S Protein RBD Induces Protective Immunity. Int J Mol Sci. 2022 Nov 8;23(22):13716. doi: 10.3390/ijms232213716.