单基因单肿瘤生信套路，来试试看

今天和大家分享一篇发表在《Frontiers in Immunology》的单基因单肿瘤套路的文章，题目是“ERO1L is a Novel and Potential Biomarker in Lung Adenocarcinoma and Shapes the Immune-Suppressive Tumor Microenvironment”。马上就要春节啦，大家这一年是不是有很多收获呢？抓住春节前最后的小尾巴一起来学习这篇文章吧，提前祝大家新年快乐呦~

一、摘要

背景：内质网氧化还原蛋白-1样(ERO1L)基因编码一种已知与缺氧相关的内质网腔定位糖蛋白，然而，ERO1L在肺腺癌(LUAD)形成肿瘤免疫微环境(TIME)中的作用尚不清楚。

方法：本研究从公共数据库中获取原始数据集(包括RNA-seq、甲基化、sgRNA-seq、表型和生存数据)。对这些数据进行了分析，并用来探索ERO1L在免疫渗透中的生物景观。表达数据用于表征样品。利用基因标记和细胞定量，确定间质和免疫浸润。这些发现被用来预测免疫治疗的敏感性。

结果：本研究发现ERO1L在LUAD组织中的表达明显高于正常组织。这种过度表达被发现是ERO1L启动子低甲基化的结果。ERO1L的过表达通过募集免疫抑制细胞，包括调节性T细胞(Tregs)、肿瘤相关成纤维细胞、M2型巨噬细胞和髓系来源的抑制细胞，导致了免疫抑制TIME。使用肿瘤免疫功能障碍和排斥(TIDE)框架，发现ERO1L-high组的患者对免疫治疗的应答率明显低于ERO1L-low组。机制分析表明，ERO1L过表达与JAK-STAT和NF-kB信号通路上调有关，从而影响趋化因子和细胞因子模式。

结论：ERO1L的过表达与LUAD患者预后不良有关。ERO1L的过表达提示缺氧诱导的免疫抑制TIME，这被证明在LUAD患者中对免疫治疗产生耐药性。需要进一步的研究来评估ERO1L作为LUAD免疫治疗疗效生物标志物的潜在作用。

二、流程图

三、结果简述

一、ERO1L在泛癌组织和 LUAD中的表达

1、为了确定ERO1L在泛癌中的mRNA表达谱，分析了Oncomine数据库中ERO1L的表达水平。对泛癌组织和正常组织中ERO1L mRNA表达水平的比较，确定了9种类型的癌症，其中ERO1L mRNA表达水平升高。这些类型的癌症包括膀胱癌、脑癌、中枢神经系统癌、结直肠癌、胃癌、肾癌、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌和胰腺癌。此外，还鉴定了三种ERO1L mRNA表达水平降低的癌症。这些类型的癌症包括食道癌、头颈癌和白血病(图A)。

同样，在TCGA数据库中，与正常组织相比，泛癌组织中ERO1L mRNA的表达水平有所升高。其中ERO1L在肺腺癌和肺鳞癌中的表达水平显著升高。

为了进一步研究ERO1L在泛癌中的mRNA表达水平，分析了TCGA中的RNA测序数据。研究发现，与正常组织相比，泛癌组织中ERO1L mRNA的表达水平有所升高(图B)。这一发现与作者对肿瘤学数据库数据的分析一致，该数据库显示ERO1L在肺腺癌(LUAD；p<0.001)和肺鳞癌(LUSC；p<0.001)中的表达水平显著升高。

2、为了研究LUAD中ERO1L的mRNA表达水平，对GEO数据库中的数据集进行了进一步的分析。在该分析中，包括四个数据集(GSE7670、GSE31210、GSE32863和GSE19188)，共526个样本。这包括356例肿瘤组织和170对正常组织。对表达谱进行归一化处理后，发现LUAD组织中ERO1L mRNA的表达水平明显高于正常组织。另外，用TCGA检测了LUAD中ERO1L的mRNA表达。类似地，与正常组织相比，LUAD组织中ERO1L mRNA的表达水平显著升高。

这些ERO1L mRNA的表达水平在LUAD中得到证实。作为下一步的合乎逻辑的步骤，作者研究了ERO1L在LUAD中的蛋白表达。用人类蛋白图谱(HPA)数据库分析发现，LUAD患者的ERO1L免疫组化染色呈阳性。在HPA数据库中发现11例LUAD患者，这些患者都有ERO1L蛋白阳性表达(图D-G)。

二、ERO1L过度表达与LUAD预后不良相关

为了研究ERO1L在LUAD患者中的表达与预后的关系，对Kaplan-Meier数据库中的生存数据进行分析。结果表明，在LUAD患者的OS(HR：1.52，95% CI：1.27-1.82；图A)和RFS(HR：1.93，95% CI：1.47-2.53；图B)方面，ERO1L的过度表达与较差的预后相关。

为了验证ERO1L是LUAD患者潜在的生物标志物这一假设，对从TCGA程序获得的RNA测序数据进行了生存分析。分析表明，ERO1L过表达与总生存期缩短(HR：2.20，95% CI：1.71~2.56；图C)和无病生存期(HR：1.43，95% CI：1.10~1.79；图D)显著相关。通过相关分析和多元线性回归分析，发现ERO1L的表达水平与LUAD患者特定的临床病理特征相关(图E)。

此外作者应用类器官模型研究了ERO1L的生物学功能。作者设计一种实验方法获得了不同颜色标记的ERO1L过表达的类器官。当用cDNA转导时，类器官会变成红色，表明ERO1L的过表达（图F）。作者检测了感染的类器官，计算了第1代到第4代的嵌合类器官的比率，嵌合类器官的初始百分比约为16%，传代3次后逐渐增加到75%（图F）。此外，类器官细胞的倍增时间从第1代的5天到第6天减少到第4代的2天到2天半。还进行了类器官ERO1LcDNA的转导。每组接种1000个细胞，培养14天（第2代）。与对照组相比，过表达ERO1L的细胞球体形成增强（图G）。因此，作者得出结论，ERO1L过表达的类器官在发育中逐渐获得优势，这可以随着时间的推移而延长。

三、ERO1L 启动子甲基化和共表达分析

1、为了阐明ERO1L基因表达的机制，作者检测了503例标本中ERO1L基因启动子甲基化水平。与正常组织相比，LUAD组织中ERO1L甲基化水平显著降低(图A)。肿瘤分期亚组分析显示，ERO1L启动子甲基化水平在IV期患者中降低最为显著(图B)。相关分析显示ERO1LmRNA水平与甲基化水平呈显著负相关。

为了分析与ERO1L甲基化和表达相关的临床结果，对TCGA数据库中468名患者的数据集进行了分析。这些数据集都包含与甲基化、表达和生存特征相对应的数据。通过Sankey图进行通径分析。这量化和可视化了不同线条和宽度的转变，并描述了跨越肿瘤分期、启动子甲基化水平、ERO1L mRNA表达和生存状态的路径和模式(图C)。结果表明，ERO1L启动子的低甲基化可能诱导ERO1L mRNA的过度表达，最终导致LUAD患者预后不良。

2、为了研究与ERO1L关系密切的蛋白质，对TCGA和Oncomine数据库中的表达数据进行了共表达分析。通过重叠共表达结果和模块挖掘，发现29个蛋白与ERO1L密切相关。这包括ERO1LB、GPX7、GPX8、P4HB、INS、PDIA3、PDIA4、PDIA6、TXNDC5和ERp44等。基于这些结果，建立了ERO1L共表达模块的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络(图D)。此外，通过GO分析(图E)和KEGG分析(图F)研究了该模块的生物学功能。有趣的是，这些基因被发现与重要的过程如内质网胁迫反应、活性氧反应、氧化还原过程和糖酵解过程密切相关。总体而言，该模块被证明与缺氧反应以及HIF-1信号通路密切相关。这些也可能在塑造时间方面发挥作用。

四、ERO1L表达与免疫细胞标志物的相关性

为了解ERO1L与免疫细胞浸润的关系，对ERO1L与免疫细胞标志物的相关性进行了分析。ERO1L的表达与浸润淋巴细胞的标志物(包括调节性T细胞(Tregs)、耗竭T细胞、巨噬细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)、髓系抑制细胞(MDSCs)和肿瘤相关成纤维细胞(CAFs))有很强的相关性，从而表明免疫抑制细胞的浸润是由ERO1L信号介导的(图A)。ERO1L的表达与M2型巨噬细胞表型呈正相关，与M1型巨噬细胞表型呈负相关。这意味着ERO1L的过度表达可能表明M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞的分化(图B)。

五、ERO1L介导的免疫抑制肿瘤微环境塑造

为了确定ERO1L表达是否影响TIME，在Timer2.0数据库中计算ERO1L表达和TIME浸润的系数。在肿瘤浸润淋巴细胞中，免疫活性细胞包括B细胞、CD8+T细胞和NK细胞与ERO1的表达呈负相关。调整肿瘤纯度后，免疫抑制细胞CAF和MDSCs与ERO1L表达呈正相关(图C)。

由于ERO1L与CD4+T细胞呈正相关，通过对GSE99254单细胞测序数据的分析，进一步研究了CD4+T细胞的异质性。降维分析(t-SNE)显示ERO1L在大多数CD4+T细胞群中高表达。这与作者之前的发现是一致的(图D)。CD4-CTLA4簇(C9簇)和CD4-CXCL13簇(C7簇)分别代表抑制性T细胞和耗竭T细胞，其ERO1L表达水平最高。为了进一步证实ERO1L在浸润细胞中的表达，分析了4个项目(GSE7670、GSE31210、GSE32863和GSE19188)的单细胞测序数据。结果显示，ERO1L的表达与B细胞、T细胞、NK细胞、内皮细胞、巨噬细胞、单核细胞、MDSCs和CAF等浸润细胞水平密切相关(图E)。

值得注意的是，MDSCs在各种癌症类型的免疫抑制中起着关键作用。近年来，越来越多的证据表明MDSCs是免疫抑制肿瘤微环境背后的主要驱动力。基于ERO1L和MDSC之间的强相关性，根据ERO1L和MDSC的表达谱构建Cox比例风险模型进行生存分析(图F)。结果显示，ERO1L和MDSCs同时低水平患者的OS明显好于同时高ERO1L和MDSCs的患者(HR：1.55，95% CI：1.12~1.84，log-ranep<0.001)。这表明ERO1L和MDSC的高水平表达可以预测LUAD患者的不良预后。在与缺失或正常二倍体相比，ERO1L的高表达水平是拷贝数变化(包括扩增和扩增)的结果，也有显著差异。综上所述，这些结果表明ERO1L的过表达与免疫抑制细胞的浸润和免疫活性细胞的缺乏密切相关，从而形成了免疫抑制TIME。

六、ERO1L与免疫治疗反应

基于ERO1L过度表达形成免疫抑制TIME的概念，推测高水平的ERO1L也可能导致免疫治疗抵抗。为了进一步研究这一假设，作者使用Estimate软件分析了ERO1L-low和ERO1L-High样本的间质和免疫细胞浸润水平。与ERO1L高表达相比，ERO1L低表达伴有较高的基质细胞和免疫细胞丰度，这与较高的估计分数有关。这表明免疫炎症TIME很可能是免疫治疗的易感因素(图A)。为了更详细地探讨这个问题，使用了TIDE评分。该评分是一个旨在评估肿瘤免疫逃逸潜力的计算框架，是预测免疫治疗反应的替代生物标记物。评分显示ERO1L-low组有效率(86.0%)明显高于ERO1L-High组(31.0%)(图B，C)。与ERO1L-low组相比，ERO1L-High组的MDSCs(p< 0.001)和免疫功能障碍(p < 0.001)评分较高，而CD8 + T细胞(p < 0.001)评分较低（图5D）。这些结果表明，ERO1L是一种生物标志物，在预测LUAD患者的免疫治疗反应方面具有潜在的应用价值。

七、ERO1L诱导免疫抑制肿瘤微环境的机制

为了探究ERO1L相关免疫抑制肿瘤微环境的潜在机制，作者进行GSEA基因富集分析以确定ERO1L过表达产生的转录特征是否与先前研究的其他条件显着相关。结果显示缺氧特征和血管内皮生长因子（VEGF）上调特征ERO1L高表达组显著富集。而且，GSEA还揭示了当ERO1L信号上调时，JAK-STAT和NF-Kb信号通路的基因特征通常富集（图B）。检测这两条通路中的基因表达水平。包括JAK1、JAK2、STAT1、STAT2、STAT3、NF-kB1、NF-kB2、RelA、RelB、c-Rel。与之前的研究结果一致，ERO1L过表达与这些基因之间观察到显著相关性（图6C）。进一步探讨了ERO1L的表达是否会影响肿瘤细胞和浸润的免疫细胞分泌的细胞因子和趋化因子的模式。通过TCGA表达谱分析，发现肿瘤分泌的细胞因子和趋化因子(如CSF-1、IL-1b和IL6)与ERO1L的过度表达呈正相关(图D)。综上所述，这些数据提示了ERO1L相关免疫抑制TIME的潜在机制。

四、总结

作者通过多个数据库使用肺腺癌RNA-seq、甲基化、sgRNA-seq和生存数据并进行泛癌分析、预后分析、甲基化分析、共表达分析、免疫相关性和肿瘤微环境分析。结果表明与正常组织相比，ERO1L在LUAD中显著过表达，并且与LUAD患者的预后密切相关。并且ERO1L的过度表达与免疫抑制细胞的浸润和免疫活性细胞的缺陷密切相关，可以通过诱导免疫抑制TIME产生致癌作用。在单基因单肿瘤的生信文章中，这篇文章的分析方面可以说是非常全面了，很值得感兴趣的小伙伴们学习借鉴。

原文转自：医学僧的科研日记（ID:zzudoctor）