肺纤维化动物模型介绍 「附：小鼠博来霉素肺纤维化模型的详细步骤」

肺纤维化（pulmonary fibrosis，PF)是肺组织异常修复造成不可逆损伤的一类疾病，以炎症和细胞外基质沉积为特征，呈进展性和致死性的弥漫性肺间质疾病，其中，特发性肺间质纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)发病率最高。

肺纤维化严重影响人体呼吸功能，表现为干咳、进行性呼吸困难，且随着病情和肺部损伤的加重，患者呼吸功能不断恶化。其死亡率高，病因极其复杂，尚无有效的治疗方法，并且预后极差。

构建一个理想的肺纤维化模型，不仅有助于进一步筛选肺纤维化生物标志物，同时也为深入研究肺纤维化发病机制及动物临床治疗肺纤维化和研发新药提供科学基础。

本文总结了一些常用的的肺纤维化模型及模型评价指标，为肺纤维化动物模型建立提供参考。

动物种类的选择

目前肺纤维化动物模型有采用体型较小的小鼠、大鼠及其他鼠类(如仓鼠等)和兔，也有选用体型较大的犬、猪、羊等。模型选用的动物种类因研究目的和造模方法不同而异。

大、小鼠因体型小、体重轻、价格便宜、操作简便，成为被选用最多的造模动物，但因其体型太小不适用于放射影像学的研究。体型较大的犬、猪等动物适用于放射影像学的研究。

常见肺纤维化动物模型

目前用于模型制作的诱导剂很多，如博来霉素、百草枯、高浓度氧、石棉以及放射线等均可以引起肺部损伤，最终导致肺纤维化，其中以博来霉素最为常用。

01 药物／毒物诱导动物模型

博来霉素诱导模型

博来霉素（bleomycin，BLM）是由轮枝链霉菌产生的碱性糖肽类物质的多组份复合抗生素，具有抗肿瘤作用，其毒副作用之一是引起肺纤维化。

其诱导肺纤维化的机制，普遍认为是BLM诱导DNA的断裂，产生自由基，诱导氧化应激反应，引起细胞凋亡或坏死，诱导炎症反应和纤维化。

由于病理组织学改变与人类肺纤维化最为接近，加上博来霉素价格低廉，容易获取且重现性好，在过去几十年中，博来霉素诱导的肺纤维化动物模型是应用最普遍的实验性肺纤维化模型。

博来霉素的给药途径包括肺特异性给药(气管内滴人)和系统性给药(腹腔注射、皮下注射和静脉注射)。采用不同的给药途径，博来霉素最初损伤的细胞类型不同。因此，在用博来霉素造模时，最初的损伤部位可通过给药途径控制。

气管内给药是最为常用的给药途径，方法是BLM进入动物气管后立即通过直立旋转等手段，使药物均匀分布于肺组织，导致肺部病变发生纤维化。

气管给药可以是一次性的，也可以是重复多次的。其中使药物进入动物气管内有三种方法：①直接支气管插管，然后滴入BLM。②麻醉动物动物，手术剖开颈部皮肤，钝性分离肌肉组织露出支气管，然后注入BLM。③将BLM水溶液雾化，使动物自行吸入。

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气管内给药详细造模步骤

实验动物：6周龄，体重20g左右，C57BL/6小鼠（或BALB/c小鼠）适应性饲养一周后进行实验。

制备环境：屏障环境

制备周期：4周

造模步骤：小鼠按照麻醉剂剂量麻醉后固定，呈仰卧位姿势，气管居中，暴露颈部，剪毛备皮，无水乙醇消毒后沿颈部中线开口（开口大小：0.5-1cm左右）缓慢钝性分离至气管，此时需要轻柔操作，减少因手术操作造成的气管损伤。

使用注射器（1ml或者微量注射器，胰岛素针不失为好的选择），针头几乎平行于气管平面，经气管软骨环间隙朝向心端插入气管内，回抽无阻力，则注入少量的博来霉素溶液（不超过0.2 ml/只，肺内大量积液会导致动物的死亡）。

注射完毕后，缝合伤口，后将动物直立1-3 min，适度左右转动，并轻轻按摩小鼠胸部，保证博来霉素在肺内均匀分布，动物清醒后常规饲养。（3天左右即可出现损伤，体重降低等症状）28d后收集样本。

造模图片：

PS：

（1）博来霉素（盐酸博来霉素或硫酸博来霉素均可，给药时需换算为博来霉素）使用生理盐水溶解。博来霉素剂量当天配置当天使用。

（2）采用气管滴入法，成模率、成模速度较其他给药方式快。

（3）纤维化与博来霉素的剂量和溶液体积有很大关系，一般在7-21天出现，时间越久模型组死亡率可能会比较高。

（4）另外博来霉素诱导的肺纤维化模型在不同品系的动物上有很大的差异，C57Bl/6小鼠的敏感程度显著高于BALB/c小鼠。

优点：易于操作、可重复性强，在阐明肺纤维化与细胞因子、生长因子和信号通路的关系上具有重要作用，还广泛应用于潜在抗纤维化药物的筛选。

缺点：没有复制出人IPF进展慢、不可逆这两个特点。

异硫氰酸荧光素诱导模型

异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)也可用于诱导肺纤维化。

诱导机制：FITC可以直接作用与气道，作为半抗原与其他的肺组织蛋白结合，通过趋化因子受体2(CCR2)与CCL12配体的相互作用使纤维细胞进入肺，成为一个长时间的刺激因素，诱导肺纤维化。

造模步骤：FITC经气管内给药至肺部，约14-21d可以形成肺纤维化。常用BALB/c和C57BL/6小鼠。

优点：FITC是带荧光的荧光素荧光分子，能确定周围纤维化的沉积区域，可以用免疫荧光的方法来定位肺受损伤部位。

缺点：无临床相关性，纤维化反应程度可变性大。每次给药时FITC都必须使用新鲜溶液，由于超声处理的FITC颗粒的大小不同，其每次作用效果不同，使纤维化的标准化和重复性有很大的困难。并且，若超声处理的时间较长，FITC的颗粒较小，会增加急性毒性，引起早期肺损伤。


百草枯诱导模型



造模步骤：百草枯给药途径主要是灌胃给药和腹腔注射，采用的动物一般为大鼠和小鼠。腹腔注射20mg/kg（大鼠）或10mg/kg（小鼠）一段时间后即可造模（5-9d发生，2-3周达高峰）。也可以大剂量口服百草枯用来造模：口服50mg/kg后120h即形成肺纤维化。



02 环境因素诱导模型



主要包括以下三种类型：



长时间暴露于高氧环境中可导致多器官和组织损伤。肺是高浓度氧吸人后直接作用的靶器官，因此最易受损，形成高氧性急性肺损伤并进一步发展成渐进性肺纤维化。



目前，高氧诱导的急性肺损伤动物模型常采用的氧浓度为95-100％，暴露时间为72-96小时。长时间暴露下50-85％氧浓度环境中可诱导形成渐进性肺纤维化。



啮齿类动物对高氧的耐受性具品种差异，在>95％氧浓度环境中暴露48-60小时，Fischer大鼠相比于SD大鼠，胸腔积液更多，总蛋白浓度更高。同样地，C57BL/6小鼠比C3H/HeJ小鼠对高氧更敏感。



此类模型主要应用于模拟临床氧疗引起的急性肺损伤和肺纤维化。



辐射诱导模型



在临床上，放射性肺损伤成为胸部肿瘤放疗后常见的严重并发症之一，因此建立放射性诱导肺纤维化模型具有重要的意义。



诱导机制：辐射通过使DNA损伤直接诱导肺泡上皮细胞死亡，肺泡巨噬细胞涌入到这些受损的区域，随后激活单核细胞，产生炎症因子、促纤维化细胞因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和生长转化因子-β(TGF-β)等，参与肺纤维化的发展过程。



造模方法：放射性纤维化模型具有剂量依赖性，当辐射小于5Gy时，几乎不会发生纤维化；小鼠全身照射12～15Gy在第20周出现肺纤维化。若辐射剂量较大，纤维化将会持续6个月。



优点：小鼠在照射后，晚期作为放射性肺纤维化模型，早期可作为放射性肺炎的模型。放射性肺纤维化模型是验证骨髓间充质干细胞修复作用的模型之一。



缺点：模型造模时间长，实验成本高。



无机粉尘诱导模型



将无机粉尘如石棉、二氧化硅等滴入啮齿类动物肺中可导致纤维结节形成，模拟接触石棉和二氧化硅的职业人群中出现现的白棉肺和矽肺疾病过程。



①石棉诱导模型



石棉肺在暴露人群中是一种严重的肺纤维化疾病。



诱导机制：石棉纤维的特异性沉积可以诱导氧化应激，损伤肺泡上皮细胞，巨噬细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒也参与肺损伤的过程。



造模方法：利用石棉气管滴注和雾化吸人两种方式可以诱导小鼠肺纤维化。气管滴注模型在第7天出现纤维化，第14天纤维化成熟，吸入模型在1个月左右才出现纤维化。



优点：有助于了解肺纤维化的病理发展。



缺点：石棉能够引起人罕见的间皮瘤发生，操作人员在应用时应该加强防护。



②二氧化硅诱导模型



二氧化硅滴注到小鼠肺部可以产生纤维结节，与一些职业暴露人群中的矽肺结节性纤维化疾病类似。



诱导机制：二氧化硅在肺中沉积，形成持续的毒性刺激炎症反应，使纤维化结节在二氧化硅周围形成。



造模方法：通过雾化吸入、气管滴注二氧化硅等方式诱导动物肺纤维化。



优点：肺部的二氧化硅粒子难以清除，能形成一个持久性刺激。二氧化硅模型的一个重要特征就是巨噬细胞的炎症复合体(NALP3)被激活，在研究肺纤维化的先天免疫调节方面具有重要作用。



缺点：建模时间长：纤维化无纤维细胞灶、时间异质性不明显、无上皮细胞增生；雾化吸人二氧化硅需要专门的雾化吸人设备；具有种属依赖性。



模型评价指标

（1）监测实验期间各组小鼠精神状态、体重变化、摄食饮水情况、皮毛色泽、呼吸及对外界剌激的反应情况，同时记录死亡情况并进行死亡原因分析。



（2）取样观察：肉眼观察肺组织的情况，包括肺组织色泽、体积有无缩小、有无出血点和结节、弹性、硬度等。





（3）肺系数(Lung coefficient)：肺系数＝肺湿重(mg)/体重(g)。肺系数低表明其纤维化程度轻，肺系数高表明其纤维化程度重。



（4）组织病理检测：小鼠经腹腔麻醉后，开胸暴震肺部组织，取右侧肺下叶放入4%甲醛溶液中固定，然后进行蔗糖梯度脱水、石蜡包埋和切片，分别进行HE和Masson染色，光学显微镜下观察肺组织炎症及纤维化情况。



HE染色观察肺组织肺泡炎程度；Masson染色观察肺组织肺纤维化程度。



肺组织肺泡炎评分：无肺泡炎计1 分，轻、中、重度肺泡炎分别计2、3、4 分。轻度肺泡炎主要表现为单核细胞浸润，肺泡间隔增宽但结构正常，浸润局限于近胸膜部，受累面积小于全肺的20 %；中度肺泡炎受累面积占全肺20 % ~ 50 %；重度肺泡炎受累面积占全肺的50 % 以上，偶见肺泡腔内有单核细胞及出血造成实变。

肺纤维化程度评分：无纤维化计1 分，轻、中、重度肺纤维分别计2、3、4 分。轻度纤维化主要累及胸膜及胸膜下肺间质，肺泡结构紊乱，受累面积小于20 %；中度纤维化受累面积占全肺的20 %~50 %；重度纤维化受累面积占全肺的50 % 以上，肺实质紊乱，并有融合，可见大小不等的囊气腔。


对比正常组与模型组。模型小鼠肺组织间质毛细血管出现淤血，扩张现象，肺泡壁变厚，甚至出现断裂，肺泡腔内出现以中性粒细胞为主的炎性细胞浸润。





（5）测定肺组织羟脯氨酸含量：吸光度法



（6）Western blotting 检测鼠肺组织中相关目标蛋白表达



（7）检测转化生长因子βl (transform growth factor β1，TGF-β1)




END